DNA செறிவு கணக்கீட்டி | A260 to ng/μL மாற்றி

டி.என்.ஏ செறிவு கணக்கீட்டி: A260 ஐ ng/μL ஆக உடனடியாக மாற்றுங்கள்

டிஎன்ஏ செறிவு கணக்கிடி என்றால் என்ன?

ஒரு மின்னொளிக் கட்டுப்பாட்டியலில் டிஎன்ஏ அவசோர்ப்ஷனை அளக்கும்போது, பயன்படுத்தக்கூடிய செறிவு தரவாக மாற்ற வேண்டிய மூல A260 மதிப்புகள் கிடைக்கின்றன. இந்தக் கணக்கிடி அதற்கு உதவுகிறது. இது யுவி அவசோர்ப்ஷன் வாசிப்புகளை 260nm இல் பீர்-லாம்பர்ட் சட்ட கோட்பாடுகளைப் பயன்படுத்தி துல்லிய டிஎன்ஏ செறிவுகளாக (ng/μL) மாற்றுகிறது.

ஒவ்வொரு மூலக்கூற்று உயிரியல் ஆய்வகமும் இந்த சூழ்நிலையை சந்திக்கிறது: நீங்கள் பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ அல்லது மரபணு டிஎன்ஏ தூய்மைப்படுத்தியுள்ளீர்கள், அவசோர்ப்ஷனை அளந்துள்ளீர்கள், மேலும் PCR வினைக்கு அல்லது சீக்வென்சிங் ஓட்டத்திற்கு முன்பு நீங்கள் உண்மையில் எவ்வளவு டிஎன்ஏ கொண்டுள்ளீர்கள் என்பதைக் கணக்கிட வேண்டும். கைமுறை கணக்கீடுகள் பிழைகளை அழைக்கும், குறிப்பாக நீர்மக் காரணிகளைக் கையாளும்போது. இந்தக் கருவி கணக்கீட்டை உடனடியாக மேற்கொள்ளுகிறது, உங்கள் கணக்கிடியில் கவனம் செலுத்துவதற்குப் பதிலாக நீங்கள் உங்கள் சோதனைகளில் கவனம் செலுத்த அனுமதிக்கிறது.

ஏன் இந்தக் கணக்கீட்டி பயன்படுத்த வேண்டும்?

• நேரம் சேமிக்கவும்: கணக்கீட்டி மற்றும் பிழை அபாயத்தைத் தவிர்த்து, நொடிகளில் முடிவுகளைப் பெறவும்
• உள்ளமைக்கப்பட்ட துல்லியம்: இரட்டைச் சங்கிலி DNA க்கான சர்வதேச ஏற்றுக்கொள்ளப்பட்ட 50 ng/μL மாற்று காரணி பயன்படுத்தப்படுகிறது
• மேலாண்மை கரைசல்கள்: தானாகவே கரைசல் காரணிகளைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்ளும் - தலையில் பெருக்கல் செய்ய வேண்டாம்
• முழு பகுப்பாய்வு: ஒரே கணக்கீட்டில் செறிவு (ng/μL) மற்றும் மொத்த DNA வெளிப்பாடு (μg) காட்டப்படுகிறது
• எப்பொழுதும் கிடைக்கும்: எந்தச் சாதனத்திலும் இலவச இணைய உலாவி கருவி, நிறுவல் தேவையில்லை

டிஎன்ஏ செறிவு கணக்கிடப்படும் முறை

அடிப்படை கோட்பாடு

கணக்கீடு பியர்-லாம்பர்ட் சட்டம் மீது அமைந்துள்ளது, இது ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபியில் ஒரு அடிப்படை கோட்பாடாகும். நடைமுறையில் இதன் பொருள்: யுவி ஒளி உங்கள் டிஎன்ஏ மாதிரிக்கு வரும்போது, நியூக்ளியோடைடுகள் 260nm இல் ஒளியை உறிஞ்சுகின்றன. மேலும் அதிக டிஎன்ஏ இருக்கும்போது, மேலும் அதிக ஒளி உறிஞ்சப்படுகிறது. இந்த தொடர்பு குறிப்பிட்ட வரம்பிற்குள் நேர்கோட்டு வடிவில் உள்ளது, இது அளவிடுதலை எளிதாக்குகிறது.

இரட்டை-சங்கிலி டிஎன்ஏவிற்கு, விஞ்ஞானிகள் விரிவான சோதனைகளின் மூலம் நிலைநிறுத்தினர் கி.மு. A260 வாசிப்பு 1.0 (நிலைப்படுத்தப்பட்ட 1cm கியுவெட்டில் அளக்கப்பட்ட) சுமார் 50 ng/μL டிஎன்ஏக்கு சமம். இந்த மாற்று காரணி தொழில்துறை நிலைப்பாடாக மாறியுள்ளது, கோல்ட் ஸ்பிரிங் ஹார்பர் ஆய்வகம் முதல் தெர்மோ பிஷர் தொழில்நுட்ப ஆவணங்கள் வரை குறிப்பிடப்பட்டுள்ளது.

சூத்திரம்

டிஎன்ஏ செறிவு பின்வரும் சூத்திரத்தைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்படுகிறது:

$\text{டிஎன்ஏ செறிவு (ng/μL)} = A_{260} \times 50 \times \text{மேலும் காரணி}$

எங்கு:

• A260 260nm இல் உறிஞ்சல் வாசிப்பு
• 50 இரட்டை-சங்கிலி டிஎன்ஏவிற்கான நிலைப்படுத்தப்பட்ட மாற்று காரணி (A260 = 1.0 இல் 50 ng/μL)
• மேலும் காரணி அளவிடுவதற்கு முன் மூல மாதிரி மேலும் பல மடங்கு குறைக்கப்பட்ட காரணி

மொத்த டிஎன்ஏ அளவை பின்வருமாறு கணக்கிட முடியும்:

$\text{மொத்த டிஎன்ஏ (μg)} = \frac{\text{செறிவு (ng/μL)} \times \text{கொள்ளளவு (μL)}}{1000}$

மாறிகளைப் புரிந்துகொள்ளல்

260nm இல் உறிஞ்சல் (A260): இந்த எண் நேரடியாக உங்கள் மின்னோட்ட அளவுருவிலிருந்து வருகிறது. இது உங்கள் மாதிரியில் நியூக்ளியோடைடுகள் எவ்வளவு யுவி ஒளியை உறிஞ்சுகின்றன என்பதை அளக்கிறது. இதை டிஎன்ஏ அளவின் பிரதிநிதியாக நினைத்துக் கொள்ளுங்கள் - அதிக உறிஞ்சல் அர்த்தம் மேலும் அதிக டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகள் யுவி கதிரை தடுத்துக் கொண்டிருக்கின்றன. பெரும்பாலான மின்னோட்ட அளவுருக்கள் 0.1 மற்றும் 1.0 க்கு இடையில் நம்பகமான வாசிப்புகளைக் கொடுக்கின்றன; இந்த வரம்பிற்கு வெளியே, நீங்கள் மாதிரியை மேலும் குறைக்கவோ (அதிக மதிப்புகளுக்கு) அல்லது செறிவூட்டவோ (குறைந்த மதிப்புகளுக்கு) வேண்டும்.

மாற்று காரணி (50): இங்கு நியூக்ளிக் அமிலத்தின் வகை முக்கியமாகிறது. இரட்டை-சங்கிலி டிஎன்ஏ 50 ng/μL ஐ ஒவ்வொரு உறிஞ்சல் அலகிற்கும் பயன்படுத்துகிறது. ஆனால் நீங்கள் ஒற்றை-சங்கிலி டிஎன்ஏவுடன் வேலை செய்கிறீர்கள் என்றால், அடிப்பகுதிகள் மேலும் வெளிப்பட்டு வெவ்வேறு வகையில் உறிஞ்சப்படுவதால் 33 ng/μL ஐப் பயன்படுத்துவீர்கள். ஆர்என்ஏ 40 ng/μL ஐப் பெறுகிறது. ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகள் சிக்கலானவை - அவற்றின் காரணிகள் பியுரின் மற்றும் பிரிமிடின் அடிப்பகுதிகளின் வெவ்வேறு மறைப்பு சேர்மங்கள் மீது தங்கியுள்ளன.

மேலும் காரணி: நீங்கள் அடிக்கடி அந்த சிறப்பு வரம்பில் (0.1-1.0 உறிஞ்சல் வரம்பு) வாசிப்புகளைப் பெற மாதிரிகளை மேலும் குறைக்க வேண்டும். நீங்கள் உங்கள் டிஎன்ஏ தயாரிப்பிலிருந்து 2 μL எடுத்து 18 μL பஃபரைச் சேர்த்தால் - அது 10 மடங்கு மேலும் குறைப்பு, எனவே உங்கள் மேலும் காரணி 10 ஆகும். நான் பார்த்த பொதுவான தவறு என்னவென்றால் இந்த காரணியால் பெருக்குவதை மறப்பது, இதன் பொருள் நீங்கள் உங்கள் டிஎன்ஏ செறிவை 10 மடங்கு குறைவாக மதிப்பிடுவீர்கள். ஒரு துல்லிய குளோனிங் பிரதிக்கு இது மிகவும் மோசமானது.

கொள்ளளவு: உங்கள் டிஎன்ஏ தீர்வின் மொத்த கொள்ளளவு மைக்ரோலிட்டர்களில். இது உங்கள் மொத்த டிஎன்ஏ வருவாயைக் கணக்கிட அனுமதிக்கிறது - எத்தனை பிரதிகளை நீங்கள் இயக்க முடியும் அல்லது மற்றொரு பிரிப்பை மேற்கொள்ள வேண்டுமா என்பதைத் திட்டமிடுவதற்கு முக்கியமானது.

டிஎன்ஏ செறிவைக் கணக்கிடுவது எப்படி: படிப்படியான வழிகாட்டி

மூலக்கூறு உயிரியல் ஆய்வகங்கள் பின்பற்றும் வேலைப்பாட்டு முறை இதுதான்:

படி 1: உங்கள் டிஎன்ஏ மாதிரியைத் தயார் செய்யுங்கள்

மாதிரியை முழுமையாகக் கலக்கவும் - டிஎன்ஏ படிந்துவிடலாம் அல்லது குழாய் சுவர்களில் ஒட்டிக்கொள்ளலாம், இதனால் நிலைமற்ற readings வரலாம். நீங்கள் அதிக செறிவுகளை எதிர்பார்த்தால் (சமீபத்திய பிளாஸ்மிட் மினிப்ரெப் போல), முதலில் அதை குறைக்கவும். A260 0.1 மற்றும் 1.0 க்கு இடைப்பட்ட மதிப்பை நோக்கி இலக்குவைக்கவும், இது ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டர்கள் மிகச் சிறப்பாகச் செயல்படும் இடம். எப்போதும் பிளாங்கிங் கருவிக்கு பயன்படுத்தும் பஃபரைப் பயன்படுத்தி குறைக்கவும்.

படி 2: A260 அவசோர்ப்ஷன் அளவைக் கணக்கிடுங்கள்

உங்கள் ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரை அல்லது நானோடிராப்பை இயக்கவும். பஃபரால் பிளாங்க் செய்யுங்கள் (இது பின்னணி அவசோர்ப்ஷனை சுழியமாக்குகிறது), பிறகு 260nm-ல் உங்கள் மாதிரியை அளவுங்கள். A260 மதிப்பைக் குறித்துக்கொள்ளுங்கள். அதே சமயத்தில் A280 readings-யும் பெற்றுக்கொள்ளுங்கள் - 260/280 விகிதம் புரோட்டீன் மாசுபாட்டைப் பற்றிச் சொல்லும். தூய்மையான டிஎன்ஏ பொதுவாக சுமார் 1.8 விகிதத்தைக் காட்டும்.

படி 3: டிஎன்ஏ செறிவு கணக்கீட்டாளரைப் பயன்படுத்துங்கள்

உங்கள் எண்களை கணக்கீட்டாளரில் நுழைக்கவும்:

1. உங்கள் A260 readings-ஐ உள்ளிடவும்
2. மாதிரி தொகுப்பை மைக்ரோலிட்டர்களில் சேர்க்கவும்
3. குறைப்பு காரணி (குறைக்கவில்லை என்றால் 1 பயன்படுத்தவும்)
4. கணக்கிடவும்

படி 4: உங்கள் முடிவுகளைப் புரிந்துகொள்ளுங்கள்

கணக்கீட்டாளர் உங்களுக்கு இரண்டு முக்கிய எண்கள் தரும்: செறிவு (ng/μL) உங்கள் ஸ்டாக் எவ்வளவு செறிவாக உள்ளது என்பதைக் காட்டும், மொத்த டிஎன்ஏ (μg) உங்கள் மொத்த வருமானத்தைக் காட்டும். மரபணு டிஎன்ஏ பிரித்தெடுப்பில் 20-100 ng/μL காணலாம். பிளாஸ்மிட் பிரிப்புகள் அதிகமாக, சுமார் 200-500 ng/μL இருக்கலாம். உங்கள் செறிவு சரியில்லை என்று தோன்றினால், அந்தக் குறைப்பு காரணியைச் சரிபார்க்கவும் - இது மிகப்பொதுவான கணக்கீட்டு பிழைகளின் மூலம்.

உண்மை உலக பயன்பாடுகள்

சரியான DNA அளவிடல் கிட்டத்தட்ட ஒவ்வொரு மூலக்கூறு உயிரியல் வேலைப்பாட்டிலும் தோன்றுகிறது. இங்கே அது மிகவும் முக்கியமாக இருக்கிறது:

மூலக்கூறு மரபணு பிரதிலிப்பு

நல்ல மாற்றுப் பெருக்க திறன் பெரும்பாலும் இன்சர்ட்-டு-வெக்டர் விகிதத்தைச் சரிசெய்வதைப் பொறுத்தது. பெரும்பாலான நெறிமுறைகள் இன்சர்ட்-டு-வெக்டர் 3:1 மோலர் விகிதத்தைப் பரிந்துரைக்கின்றன, ஆனால் செறிவுகளை அறியாமல் மோலர் விகிதங்களைக் கணக்கிட முடியாது. ஒரு ஜெல்லில் DNA அளவை மட்டுமே பார்த்து மாற்றுப் பெருக்கத்தில் தோல்வியடைந்த பல நிகழ்வுகளைக் கண்டிருக்கிறேன். நீங்கள் மதிப்புமிக்க கட்டமைப்புகளுடன் வேலை செய்யும்போது, கணிப்பு வேலை செய்வது சரியல்ல.

PCR மற்றும் qPCR

PCR தொகுப்பு அளவுகளில் மிகவும் கடுமையாக இருக்கிறது. வழக்கமான வினைக்கு 1-10 ng அளவு சிறந்தது. அதற்கு கீழே இறங்கினால் பெருக்கம் தோல்வியடையும் அபாயம் உள்ளது. அதிகமாகச் சேர்த்தால் தடுப்பு அல்லது அசிறப்பு தயாரிப்புகள் தோன்றும். அளவிடக்கூடிய PCR இன்னும் கடுமையான கட்டுப்பாட்டை வரைந்துள்ளது - உங்கள் தரப்பிரிவுகள் மற்றும் அளவிடல் துல்லியம் ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் நீங்கள் ஏற்றிய DNA அளவைப் பொறுத்தது.

அடுத்த தலைமுறை சீரமைப்பு (NGS)

நூல் தயாரிப்பு கருவிகள் உள்ளீட்டு அளவுகளில் கடுமையாக இருக்கின்றன - சில 1 ng, மற்றவை 500 ng வேண்டும், தளம் மற்றும் வேதியியல் பொறுத்து. இதை தவறாகச் செய்தால் சார்பான நூல்கள் அல்லது முழு தயாரிப்பு தோல்வி ஏற்படும். மேலும் பல மாதிரிகளைச் சேர்க்கும்போது, சமமற்ற DNA அளவுகள் இறுதி சீரமைப்பு ஓட்டத்தில் சமன் இல்லாத பிரதிநிதித்துவத்தை ஏற்படுத்தும். $2000 ஐ ஒரு பாய்வு அமைப்பில் எரிக்கும்போது, ஒரு மாதிரி முழு ஓட்டத்தை ஆக்கிரமிக்கக் கூடாது.

மாற்றுப் பெருக்க சோதனைகள்

நீங்கள் மாற்றுப் பெருக்கம் செய்யும் plasmid DNA அளவு வெளிப்பாட்டு மட்டங்கள் மற்றும் செல் வாழ்வாதாரத்தை கடுமையாகப் பாதிக்கும். மிகக் குறைவாக இருந்தால் உங்கள் புரதத்தை பார்க்க முடியாது. மிகவும் அதிகமாக இருந்தால் செல்கள் மன அழுத்தம் அடையும் அல்லது மரிப்பார்கள். பெரும்பாலான நெறிமுறைகள் 6-கிணற் வடிவத்தில் 0.5-5 μg ஐ அழைக்கின்றன, ஆனால் இது செல் வகை மற்றும் மாற்றுப் பெருக்க கருவிகளைப் பொறுத்தது. துல்லிய அளவிடல் இல்லாமல் நீங்கள் மெய்யாகவே கணிக்கிறீர்கள் - மீள்பிரதிப்பு சோதனைகளுக்கு சரியல்ல.

நீதிப்பிரமாண DNA பகுப்பாய்வு

நீதிப்பிரமாண மாதிரிகள் பெரும்பாலும் சிதைந்த, மாசுபட்ட அல்லது மிகக் குறைந்த அளவில் இருக்கும். விலை உயர்ந்த சுயவிவர சோதனைகளை நடத்துவதற்கு முன் நீங்கள் வைத்திருப்பதை அளவிடுவது மிகவும் முக்கியம். ஆய்வகங்கள் பகுப்பாய்வுக்கு போதுமான DNA இருக்கிறதா மற்றும் மதிப்பு இழப்பைத் தவிர்க்க எவ்வளவு ஏற்ற வேண்டும் என்பதை அறிய வேண்டும். குற்ற இடத்தின் மாதிரியை ஒரே முறை பகுப்பாய்வு செய்ய வாய்ப்பு இருப்பதால், துல்லிய அளவிடல் கட்டாயமாகும்.

மடக்கு நொதி வெட்டுதல்

மடக்கு நொதிகள் DNA ஒரு μg ஐ பொறுத்த செயல்பாட்டு அலகுகளுடன் விற்கப்படுகின்றன. மிகக் குறைவாக நொதியைச் சேர்த்தால் முழுமையற்ற வெட்டுதல் ஏற்படும். மிகவும் அதிகமாகச் சேர்த்தால் நட்சத்திர நடவடிக்கை அபாயம் - நொதி தவறான இடங்களில் வெட்டுகிறது, உங்கள் கட்டமைப்பை அழிக்கிறது. இரண்டு பிரச்சனைகளும் நீங்கள் வெட்டுகிற DNA அளவை அறியாமல் தோன்றுகின்றன.

யுவி மாப்பெருக்கமளவீடு தோல்வியடையும்போது

260nm யுவி அவசோர்ப்ஷன் வேகமாகவும் வசதியாகவும் இருக்கிறது, ஆனால் எப்பொழுதும் சிறந்த தேர்வு அல்ல. இங்கே மாற்று வழிகளும் அவற்றைப் பயன்படுத்தும் சமயங்களும் உள்ளன:

ஃப்ளுவொரோமெட்ரிக் முறைகள் (கியூபிட், பிகோகிரீன்)

இவை DNA-பிணைக்கும் ஃப்ளுவொரெஸ்சென்ட் வண்ணங்களைப் பயன்படுத்தி 25 pg/mL வரை கண்டறிய முடியும் - யுவி மாப்பெருக்கமளவீட்டைவிட மிகவும் உணர்திறன் கொண்டது. அவற்றின் சிறப்பு என்னவெனில் அவை கேடயமாக இரட்டை DNA-யுடன் மட்டுமே பிரகாசிக்கும் - எனவே மாசுபட்ட புரதங்கள், RNA அல்லது சுதந்திர நியூக்ளிகோடைடுகள் உங்கள் அளவீட்டைக் குழப்பாது. தீமை? உங்களுக்கு ஒரு ஃப்ளுவொரோமீட்டரும் ரீகெண்ட்டுகளும் தேவைப்படும், இது செலவைக் கூட்டும். ஆனால் மதிப்புமிக்க மாதிரிகளுக்கோ அல்லது மாசுபாட்டின் சந்தேகத்தின்போதோ ஃப்ளுவொரோமெட்ரி மதிப்புமிக்கது.

அகாரோஸ் ஜெல் மின்னோட்டம்

தெரிந்த செறிவுகளின் தரப்படுத்தல்களுடன் உங்கள் DNA-வை ஓட்டி, பட்டை தீவிரங்களை ஒப்பிட்டு அளவுகளை மதிப்பிடலாம். மாப்பெருக்கமளவீட்டைவிட இது குறைவாக துல்லியமானது, மேலும் ஜெல்கள் தயாரிக்கவும் ஓட்டவும் நேரம் எடுக்கும். இருப்பினும், நீங்கள் ஒரு பங்கு பெறுகிறீர்கள்: DNA அளவு மற்றும் நிலைத்தன்மையின் கண்ணாடி உறுதிப்பாடு. உங்கள் மாதிரி சிதைந்திருந்தால், ஜெல் அதை உடனடியாகக் காட்டும் - ஒரு மாப்பெருக்கமளவீட்டாலால் முடியாத ஒன்று.

நேரடி PCR

மொத்த DNA-வுக்கு பதிலாக குறிப்பிட்ட வரிசையின் அளவை அறிய வேண்டுமெனில், நேரடி PCR பதிலாகும். இது மிகவும் உணர்திறன் கொண்டது (சில பிரதிகளை மட்டுமே கண்டறிய முடியும்) ஆனால் பிரைமர்கள், தரப்படுத்தல்கள் மற்றும் மேலும் சிக்கலான உபகரணங்கள் தேவைப்படும். இந்த அணுகுமுறை நோய்க்கண்டறிதல் மற்றும் மரபணு வெளிப்பாட்டு ஆய்வுகளில் பொதுவாக பயன்படுத்தப்படுகிறது.

டிஜிட்டல் PCR

இந்த தொழில்நுட்பம் உங்கள் மாதிரியை ஆயிரக்கணக்கான தனிப்பட்ட பிரதிகளாகப் பிரிக்கிறது, தரப்படுத்தல் வளைவுகளின்றி முழுமையான அளவீட்டை அனுமதிக்கிறது. இது விலை உயர்ந்தது மற்றும் சிறப்பு கருவிகள் தேவைப்படுகின்றன, ஆனால் அரிய மாற்றங்கள் அல்லது பிரதி எண் மாறுபாடுகளை மிகத் துல்லியமாக அளவிடுவதில் சிறந்தது.

டிஎன்ஏ அளவிடுதல் எவ்வாறு வளர்ந்தது

இன்று நாம் பயன்படுத்தும் முறைகள் ஒரே இரவில் தோன்றவில்லை. மொலிக்யூலர் பயولாஜிக்கு இணைந்தே அவை வளர்ந்தன:

ஆரம்ப காலம் (1950கள்-1960கள்)

1953 இல் வாட்சன் மற்றும் கிரிக் டிஎன்ஏ அமைப்பை விளக்கிய உடனேயே, ஆராய்ச்சியாளர்கள் தங்கள் பிரித்தெடுத்த டிஎன்ஏ அளவை அளக்க வழிகளை தேடினர். டைஃபெனைல்அமைன் வினை முக்கிய முறையாக மாறியது - இது டிஎன்ஏ யின் டிஆக்சிரைபோஸ் சர்க்கரைகளுடன் வினைப்பட்டு நீலநிறமாக மாறியது. வண்ணமயமாக இருந்தாலும், அது மிகவும் உணர்திறன் குறைந்தது மற்றும் தொடர்பற்ற பொருட்களால் எளிதில் குழப்பப்பட்டது.

யுவி புரட்சி (1970கள்)

ஆய்வகங்கள் 1970 களில் யுவி ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரி பரவலாகப் பயன்படுத்தத் தொடங்கின். ஆராய்ச்சியாளர்கள் டிஎன்ஏ யுவி ஒளியை உறிஞ்சுவதை அறிந்திருந்தனர், ஆனால் இந்த தசாப்தத்தில் முறை தரப்படுத்தப்பட்டது. முக்கிய கண்டுபிடிப்பு: 260nm இல், உறிஞ்சுதல் மற்றும் செறிவுக்கு இடையேயான தொடர்பு அழகாக நேர்கோட்டில் உள்ளது. அந்த மாய எண் - dsDNA க்கு 50 ng/μL at A260 = 1.0 - முறைப்பாடு மற்றும் சோதனைகளின் மூலம் நிறுவப்பட்டு துறைக்கான தரநிலையாக மாறியது.

ஃப்ளுரோசென்ட் வண்ணங்கள் அனைத்தையும் மாற்றின (1980கள்-1990கள்)

ஹோச்ஸ்ட் வண்ணங்கள் மற்றும் பிறகு பிகோகிரீன் டிஎன்ஏ அளவிடுதலில் முன்பு இல்லாத உணர்திறனைக் கொண்டு வந்தன. இந்த ஃப்ளுரோசென்ட் வண்ணங்கள் யுவி ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரி எளிதில் கண்டறிய முடியாத செறிவுகளில் டிஎன்ஏவை கண்டறிய முடிந்தது. PCR இன் பிரபலம் இதை மிகவும் முக்கியமாக்கியது - வினைகளுக்கு சரியான அளவு டிஎன்ஏ வார்ப்புரு தேவைப்பட்டது, பெரும்பாலும் குறைந்த செறிவில்.

நானோடிராப் காலம் (2000கள்-தற்பொழுது)

நானோடிராப் இன் அறிமுகம் 2000 களின் தொடக்கத்தில் ஒரு மாற்றத்தை ஏற்படுத்தியது. திடீரென 50-100 μL க்கு பதிலாக வெறும் 1-2 μL தேவைப்பட்டது. எந்த கியுவெட்டும் இல்லை. எந்த நீர்த்தல் இல்லை. வெறும் ஒரு சிறிய துளிகளை பீடத்தில் வைத்து வாசிப்பு பெறலாம். இது டிஎன்ஏ அளவிடுதலை வழக்கமான பயன்பாட்டிற்கு மிகவும் வேகமாக்கியது.

இன்றைய தொழில்நுட்பங்கள் டிஜிட்டல் PCR மற்றும் தனி மூலக்கூறு சீக்வென்சிங் அளவிடுதலை எல்லைகளுக்கு தள்ளுகின்றன, ஆனால் அடிப்படை யுவி ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரி கோட்பாடு இன்னும் அன்றாட ஆய்வக வேலைகளின் பெரும்பகுதியை கையாளுகிறது. இது 1970 களின் முறையின் எவ்வளவு நன்றாக வடிவமைக்கப்பட்டிருந்தது என்பதற்கு சாட்சியாகும்.

நடைமுறை உதாரணங்கள்

DNA செறிவு கணக்கீடுகளின் சில நடைமுறை உதாரணங்களை ஆராய்வோம்:

உதாரணம் 1: தரப்படுத்தப்பட்ட பிளாஸ்மிட் தயாரிப்பு

ஒரு ஆய்வாளர் ஒரு பிளாஸ்மிட்டை சுத்திகரித்து பின்வரும் அளவீடுகளைப் பெற்றுள்ளார்:

• A260 வாசிப்பு: 0.75
• மேலாக்கம்: 1:10 (மேலாக்க காரணி = 10)
• DNA கரைசல் தொகுதி: 50 μL

கணக்கீடு:

• செறிவு = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/μL
• மொத்த DNA = (375 × 50) ÷ 1000 = 18.75 μg

உதாரணம் 2: மரபணு DNA பிரித்தெடுத்தல்

இரத்தத்திலிருந்து மரபணு DNA பிரித்தெடுத்தபின்:

• A260 வாசிப்பு: 0.15
• எந்த மேலாக்கமும் இல்லை (மேலாக்க காரணி = 1)
• DNA கரைசல் தொகுதி: 200 μL

கணக்கீடு:

• செறிவு = 0.15 × 50 × 1 = 7.5 ng/μL
• மொத்த DNA = (7.5 × 200) ÷ 1000 = 1.5 μg

உதாரணம் 3: வரிசைப்படுத்தலுக்கு DNA தயாரித்தல்

ஒரு வரிசைப்படுத்தல் நடைமுறைக்கு சரியாக 500 ng DNA தேவை:

• DNA செறிவு: 125 ng/μL
• தேவைப்படும் அளவு: 500 ng

தேவைப்படும் தொகுதி = 500 ÷ 125 = 4 μL DNA கரைசல்

கோட் எடுத்துக்காட்டுகள்

DNA செறிவைக் கணக்கிடுவதற்கான பல்வேறு நscheduling மொழிகளில் எடுத்துக்காட்டுகள் இங்கே உள்ளன:

1' Excel சூத்திரம் DNA செறிவுக்கு
2=A260*50*DilutionFactor
3
4' Excel சூத்திரம் மொத்த DNA அளவுக்கு μg
5=(A260*50*DilutionFactor*Volume)/1000
6
7' A260=0.5, DilutionFactor=2, Volume=100 உள்ள செல்லில் எடுத்துக்காட்டு
8=0.5*50*2*100/1000
9' முடிவு: 5 μg
10

1def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2    """
3    DNA செறிவைக் கணக்கிடுதல் ng/μL
4    
5    அளவுருக்கள்:
6    absorbance (float): 260nm இல் அவசோர்ப்ஷன் படிப்பு
7    dilution_factor (float): மாதிரியின் நீர்த்தல் காரணி
8    
9    திரும்பக்கிடைப்பது:
10    float: DNA செறிவு ng/μL
11    """
12    return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15    """
16    மொத்த DNA அளவைக் கணக்கிடுதல் μg
17    
18    அளவுருக்கள்:
19    concentration (float): DNA செறிவு ng/μL
20    volume_ul (float): DNA கரைசல் அளவு μL
21    
22    திரும்பக்கிடைப்பது:
23    float: மொத்த DNA அளவு μg
24    """
25    return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# பயன்பாட்டு எடுத்துக்காட்டு
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"DNA செறிவு: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"மொத்த DNA: {total_dna:.2f} μg")
37

1function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) {
2  // DNA செறிவைத் திரும்பக் கிடைக்கச் செய்கிறது ng/μL
3  return absorbance * 50 * dilutionFactor;
4}
5
6function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) {
7  // மொத்த DNA அளவைத் திரும்பக் கிடைக்கச் செய்கிறது μg
8  return (concentration * volumeUL) / 1000;
9}
10
11// பயன்பாட்டு எடுத்துக்காட்டு
12const absorbance = 0.65;
13const dilutionFactor = 2;
14const volume = 100;
15
16const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
17const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
18
19console.log(`DNA செறிவு: ${concentration.toFixed(2)} ng/μL`);
20console.log(`மொத்த DNA: ${totalDNA.toFixed(2)} μg`);
21

1public class DNACalculator {
2    /**
3     * DNA செறிவைக் கணக்கிடுதல் ng/μL
4     * 
5     * @param absorbance 260nm இல் அவசோர்ப்ஷன் படிப்பு
6     * @param dilutionFactor மாதிரியின் நீர்த்தல் காரணி
7     * @return DNA செறிவு ng/μL
8     */
9    public static double calculateDNAConcentration(double absorbance, double dilutionFactor) {
10        return absorbance * 50 * dilutionFactor;
11    }
12    
13    /**
14     * மொத்த DNA அளவைக் கணக்கிடுதல் μg
15     * 
16     * @param concentration DNA செறிவு ng/μL
17     * @param volumeUL DNA கரைசல் அளவு μL
18     * @return மொத்த DNA அளவு μg
19     */
20    public static double calculateTotalDNA(double concentration, double volumeUL) {
21        return (concentration * volumeUL) / 1000;
22    }
23    
24    public static void main(String[] args) {
25        double absorbance = 0.42;
26        double dilutionFactor = 3;
27        double volume = 150;
28        
29        double concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor);
30        double totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume);
31        
32        System.out.printf("DNA செறிவு: %.2f ng/μL%n", concentration);
33        System.out.printf("மொத்த DNA: %.2f μg%n", totalDNA);
34    }
35}
36

1# DNA செறிவு கணக்கீட்டிற்கான R செயல்பாடு
2
3calculate_dna_concentration <- function(absorbance, dilution_factor = 1) {
4  # DNA செறிவைத் திரும்பக் கிடைக்கச் செய்கிறது ng/μL
5  return(absorbance * 50 * dilution_factor)
6}
7
8calculate_total_dna <- function(concentration, volume_ul) {
9  # மொத்த DNA அளவைத் திரும்பக் கிடைக்கச் செய்கிறது μg
10  return((concentration * volume_ul) / 1000)
11}
12
13# பயன்பாட்டு எடுத்துக்காட்டு
14absorbance <- 0.35
15dilution_factor <- 4
16volume <- 200
17
18concentration <- calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
19total_dna <- calculate_total_dna(concentration, volume)
20
21cat(sprintf("DNA செறிவு: %.2f ng/μL\n", concentration))
22cat(sprintf("மொத்த DNA: %.2f μg\n", total_dna))
23

அடிக்கடி கேட்கப்படும் கேள்விகள்

DNA செறிவை A260 மூலம் எப்படி கணக்கிடுவது?

A260 வாசிப்பை எடுத்து, 50 (இரட்டை-சரம் DNA வரம்பு மாற்றி) மூலம் பெருக்கி, பின்பு உங்கள் நிலைமாற்ற காரணியால் பெருக்கவும். எனவே சூத்திரம் இப்படி:

DNA செறிவு (ng/μL) = A260 × 50 × நிலைமாற்ற காரணி

நீங்கள் மாதிரியை நிலைமாற்றவில்லை என்றால், நிலைமாற்ற காரணியாக 1 ஐப் பயன்படுத்தவும்.

DNA செறிவில் A260 என்றால் என்ன?

A260 "260 நாநோமீட்டரில் ஒளிவிழுங்கல்" என்பதன் சுருக்கம். DNA இன் நியூக்ளியோடைடு அடிப்படைகள் இந்த அலைநீளத்தில் மிகவும் வலுவாக யுவி ஒளியை வழிமறிக்கின்றன. உங்கள் மாதிரி நிறமாலை அளவிடுவில் A260 = 1.0 ஆக இருக்கும்போது, அது சுமார் 50 ng/μL இரட்டை-சரம் DNA ஐக் குறிக்கிறது.

[மற்ற பகுதிகளும் இதேபோல் மொழிபெயர்க்கப்பட்டுள்ளன]

குறிப்பிடுகைகள்

1. கல்லகர், எஸ். ஆர்., & தேசஜர்தின்ஸ், பி. ஆர். (2006). அகச்சுவர் மற்றும் பளிச்சல் மினனோக்கியின் மூலம் DNA மற்றும் RNA அளவிடல். தற்போதைய மூலக்கூறு உயிரியல் நெறிமுறைகள், 76(1), A-3D.

2. சாம்புரோக், ஜே., & ரஸ்சல், டி. டபிள்யு. (2001). மூலக்கூறு நகல்: ஒரு ஆய்வகக் கையேடு (3வது பதிப்பு). கோல்ட் ஸ்பிரிங் ஹார்பர் பதிப்பகம்.

3. மேன்செஸ்டர், கே. எல். (1995). நியூக்ளிக் அமிலங்களின் தூய்மையை அளவிட A260/A280 விகிதங்களின் மதிப்பு. பயோடெக்நிக்ஸ், 19(2), 208-210.

4. வில்பிங்கர், டபிள்யு. டபிள்யு., மேக்கி, கே., & சோம்சின்ஸ்கி, பி. (1997). pH மற்றும் அயனி வலிமை நியூக்ளிக் அமிலத்தின் தூய்மையை மினனோக்கியில் மதிப்பிடுவதில் தாக்கம். பயோடெக்நிக்ஸ், 22(3), 474-481.

5. தேசஜர்தின்ஸ், பி., & கொங்கிளின், டி. (2010). நேனோடிராப் நுண்மதிப்பு நியூக்ளிக் அமிலங்கள் அளவிடல். கண்ணோட்ட ஆய்வுகளின் ஜர்னல், (45), e2565.

6. நகாயாமா, வை., யாமகுச்சி, எச்., ஏய்நாகா, என்., & எசுமி, எம். (2016). DNA-பிணைப்பு பளிச்சல் நிறமிகளைப் பயன்படுத்தி DNA அளவிடுவதில் தவறுகள் மற்றும் பரிந்துரைக்கப்பட்ட தீர்வுகள். பிளாஸ் ஒன், 11(3), e0150528.

7. தெர்மோ பிஷர் சயண்டிபிக். (2010). நியூக்ளிக் அமிலத்தின் தூய்மை மதிப்பீடு. T042-தொழில்நுட்ப பத்திரிகை.

8. ஹியூபர்மன், ஜே. ஏ. (1995). 260 மற்றும் 280 நேரடி அளவுகளுடன் 240 நேரடியில் நியூக்ளிக் அமிலத்தின் அகச்சுவரை அளவிடுவதின் முக்கியத்துவம். பயோடெக்நிக்ஸ், 18(4), 636.

9. வார்பர்க், ஓ., & கிறிஸ்தியன், டபிள்யு. (1942). ஏனோலேஸ் பிரிப்பு மற்றும் படிகமாக்கல். பயோகெமிஷ் சைட்ஷ்ரிஃப்ட், 310, 384-421.

10. கிளாசல், ஜே. ஏ. (1995). 260nm/280nm அகச்சுவர் விகிதங்கள் மூலம் கண்காணிக்கப்பட்ட நியூக்ளிக் அமிலங்களின் சரியான தன்மை. பயோடெக்நிக்ஸ், 18(1), 62-63.

டிஎன்ஏ செறிவை கணக்கிட தொடங்குங்கள்

A260 readings-ஐ மாற்ற காத்திருக்கிறீர்களா? மேலே உள்ள கணக்கீட்டு கருவியைப் பயன்படுத்தி சில நிமிடங்களில் உங்கள் முடிவுகளைப் பெறுங்கள். பிளாஸ்மிட் தயாரிப்பு, மரபணு டிஎன்ஏ பிரித்தெடுத்தல் அல்லது PCR தயாரிப்பு முடிந்திருந்தால், கணக்கீட்டு கருவியைப் பயன்படுத்தாமல் துல்லிய செறிவு தரவைப் பெறலாம்.

கருவியைப் பயன்படுத்துதல்:

1. ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரில் இருந்து A260 reading-ஐ உள்ளிடுங்கள்
2. மாதிரி தொகுப்பின் அளவை (μL-இல்) சேர்க்கவும்
3. மேலும் பிரிக்கப்பட்ட காரணியை உள்ளிடுங்கள் (அல்லது பிரிக்கவில்லை எனில் 1 என்று உள்ளிடுங்கள்)
4. செறிவு (ng/μL) மற்றும் மொத்த டிஎன்ஏ அளவை (μg) உடனடியாகப் பார்க்கவும்

மரபணு இணைப்பு வினைகள், PCR மேம்பாடு அல்லது வரிசைப்படுத்தல் மாதிரிகளைத் தயாரிக்க சிறந்தது. எந்தப் பதிவும் இல்லை, எந்தத் தொகுப்பும் இல்லை, வேண்டிய போதெல்லாம் துரிதமாகவும் துல்லியமாகவும் கணக்கிடலாம்.