DNA అన్నీలింగ్ తాపమాన కాల్కులేటర్ | ఉచిత PCR Tm సాధనం

DNA అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత కాలిక్యులేటర్ అంటే ఏమిటి?

DNA అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత కాలిక్యులేటర్, దాని సీక్వెన్స్ ఆధారంగా DNA ప్రైమర్ ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రతను (Tm) అంచనా వేస్తుంది. ప్రైమర్ అణువుల్లో సగం లక్ష్య స్ట్రాండ్‌కు బంధించబడి, మిగిలిన సగం బంధించబడని ఉష్ణోగ్రతే Tm. పాలిమరేజ్ చైన్ రియాక్షన్ (PCR)లో, ప్రైమర్లు DNA టెంప్లేట్‌కు అంటుకునే ఉష్ణోగ్రతను నిర్ణయించడానికి ఈ విలువ ఉపయోగపడుతుంది.

PCRలో అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత ఎందుకు ముఖ్యమైనది

PCRలో పదేపదే వేడి చేయడం, చల్లబరచడం ద్వారా DNAలోని లక్ష్య భాగం కాపీ అవుతుంది. ప్రతి చక్రంలో మూడు దశలు ఉంటాయి. మొదట, సుమారు 95 °C వద్ద వేడి చేయడం వల్ల రెండు-స్ట్రాండ్‌ల టెంప్లేట్ విడిపోతుంది. ఈ దశను డీనేచరేషన్ అంటారు. రెండవది, రియాక్షన్ అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రతకు, సాధారణంగా 50 °C నుంచి 65 °C మధ్యకు, చల్లబడుతుంది; అందువల్ల చిన్న ప్రైమర్లు సింగిల్-స్ట్రాండ్‌లపై సరిపోలే సీక్వెన్స్‌లకు బంధించగలవు. మూడవది, ఉష్ణోగ్రత సుమారు 72 °Cకు పెరుగుతుంది; DNA పాలిమరేజ్ అనే ఎంజైమ్ ప్రైమర్లను పొడిగించి కొత్త DNA స్ట్రాండ్‌లను నిర్మిస్తుంది.

అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, ప్రైమర్లు పాక్షికంగా మాత్రమే సరిపోలే సీక్వెన్స్‌లకు బంధించి, అదనపు అనవసర DNA భాగాలను ఉత్పత్తి చేస్తాయి. అది చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, ప్రైమర్లు టెంప్లేట్‌తో స్థిరమైన బంధాన్ని ఏర్పరచలేవు; ఫలితంగా తక్కువ లేదా అసలు DNA కాపీ అవదు. PCR రియాక్షన్ విఫలమైనప్పుడు పరిశోధకులు సర్దుబాటు చేసే మొదటి సెట్టింగ్‌లలో అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత ఒకటి.

GC కంటెంట్ Tmను ఎలా ప్రభావితం చేస్తుంది

ప్రైమర్ తన లక్ష్యంతో హైడ్రోజన్ బంధాల ద్వారా జతకడుతుంది. గ్వానిన్-సైటోసిన్ (G-C) జత మూడు హైడ్రోజన్ బంధాలను ఏర్పరుస్తుంది. అడెనిన్-థైమిన్ (A-T) జత రెండు బంధాలను ఏర్పరుస్తుంది. ఎక్కువ G, C బేస్‌లున్న ప్రైమర్‌ను విడదీయడానికి ఎక్కువ వేడి అవసరం; అందువల్ల అదే పొడవున్న, ఎక్కువ A, T బేస్‌లున్న ప్రైమర్ కంటే దాని Tm ఎక్కువగా ఉంటుంది. GC కంటెంట్‌ను సాధారణంగా శాతంగా రాస్తారు: మొత్తం సీక్వెన్స్ పొడవుతో G, C బేస్‌ల సంఖ్యను భాగించి, 100తో గుణిస్తారు.

DNA అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత సూత్రం

ఈ కాలిక్యులేటర్ ప్రైమర్ పొడవును బట్టి రెండు సూత్రాల్లో ఒకదాన్ని వర్తింపజేస్తుంది.

14 న్యూక్లియోటైడ్‌లు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ పొడవున్న ప్రైమర్లకు, ఇది మార్మర్-డోటీ GC-కంటెంట్ సూత్రాన్ని ఉపయోగిస్తుంది:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

ఇక్కడ N_GC అనేది ప్రైమర్‌లోని G, C బేస్‌ల సంఖ్య; దీనిని శాతంగా కాకుండా నేరుగా లెక్కిస్తారు. N అనేది మొత్తం బేస్‌ల సంఖ్య.

14 న్యూక్లియోటైడ్‌ల కంటే చిన్న ప్రైమర్లకు, ఇది వాలెస్ నియమాన్ని ఉపయోగిస్తుంది:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G, C ప్రతి ఒక్కటి ప్రైమర్‌లోని ఆ బేస్ ఎన్నిసార్లు ఉందో సూచిస్తాయి.

రెండు సూత్రాలు సాధారణ PCR పరిస్థితులను ఊహిస్తాయి: సుమారు 50 నానోమోలార్ ప్రైమర్ మరియు 50 మిల్లీమోలార్ Na+.

ఉదాహరణ పరిష్కారం

19-బేస్ ప్రైమర్ ATGCTAGCTAGCTGCTAGCను తీసుకుందాం. దాని పొడవు 19, ఇది 14 లేదా అంతకంటే ఎక్కువ; కాబట్టి కాలిక్యులేటర్ మార్మర్-డోటీ సూత్రాన్ని ఉపయోగిస్తుంది.

• పొడవు (N) = 19
• G లెక్క = 5, C లెక్క = 5, కాబట్టి N_GC = 10, మరియు GC కంటెంట్ 10 / 19 × 100 ≈ 52.6%
• Tm = 64.9 + 41 × (10 − 16.4) / 19 = 64.9 + 41 × (−6.4) / 19 = 64.9 − 13.8 ≈ 51.1 °C

ఈ సూత్రం GC శాతం 52.6ను కాకుండా GC లెక్క 10ను ఉపయోగిస్తుంది. శాతాన్ని పొరపాటుగా ఉపయోగిస్తే Tm దాదాపు 143 °C వస్తుంది; 50 °C నుంచి 95 °C మధ్య నడిచే PCR రియాక్షన్‌కు ఇది వాస్తవిక విలువ కాదు.

ఈ కాలిక్యులేటర్‌ను ఎలా ఉపయోగించాలి

A, T, G, C అక్షరాలను మాత్రమే ఉపయోగించి ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌ను టైప్ చేయండి లేదా పేస్ట్ చేయండి. కాలిక్యులేటర్ సీక్వెన్స్ పొడవును న్యూక్లియోటైడ్‌లలో (nt), GC కంటెంట్‌ను శాతంగా, లెక్కించిన అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను డిగ్రీల సెల్సియస్‌లో చూపిస్తుంది. ఫలితాన్ని ప్రయోగశాల నోట్స్ లేదా ప్రోటోకాల్ కోసం కాపీ చేసుకోవచ్చు.

PCR అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను ఎంచుకోవడం

Tm అనేది లెక్కించిన అంచనా మాత్రమే; పనిచేసే ఉష్ణోగ్రతకు హామీ కాదు. అనేక PCR ప్రోటోకాల్‌లు లెక్కించిన Tm కంటే కొన్ని డిగ్రీలు తక్కువగా వాస్తవ అనీలింగ్ దశను ప్రారంభించి, జెల్‌పై వచ్చిన ఫలితాన్ని బట్టి సర్దుబాటు చేస్తాయి. ఒక ప్రైమర్ జతకు, సాధారణంగా తక్కువ Tm ఉన్న ప్రైమర్ విలువను ప్రారంభ బిందువుగా ఉపయోగిస్తారు. గ్రేడియెంట్ PCRలో ఒకేసారి వివిధ ఉష్ణోగ్రతల పరిధిలో అనేక రియాక్షన్‌లు నిర్వహిస్తారు; పరీక్షల ద్వారా ఉత్తమ ఉష్ణోగ్రతను కనుగొనడానికి ఇది సాధారణ పద్ధతి.

Tmను అంచనా వేసే ఇతర మార్గాలు

ఇక్కడ ఉపయోగించిన మార్మర్-డోటీ, వాలెస్ సూత్రాలు బేస్ కూర్పుపై మాత్రమే ఆధారపడిన వేగవంతమైన సుమారు లెక్కలు. ఇతర పద్ధతులు కూడా ఉన్నాయి:

• సమీప-పొరుగు థర్మోడైనమిక్స్ ప్రతి పక్కపక్కన ఉన్న బేస్‌ల జత స్థిరత్వాన్ని ఎలా ప్రభావితం చేస్తుందో పరిగణిస్తుంది; సాధారణ ప్రైమర్లకు ఇది మరింత ఖచ్చితమైన పద్ధతిగా పరిగణించబడుతుంది.
• ఉప్పు-సర్దుబాటు సూత్రాలు రియాక్షన్ బఫర్‌లోని Na+ లేదా K+ అయాన్ల సాంద్రతకు సవరణను జోడిస్తాయి; ఉప్పు సాంద్రత పెరిగితే DNA ద్వి-స్ట్రాండ్ స్థిరపడి Tm పెరుగుతుంది.

వేర్వేరు కాలిక్యులేటర్‌లు ఒకే ప్రైమర్‌కు వేర్వేరు Tm విలువలను చూపవచ్చు, ఎందుకంటే అవి వేర్వేరు సూత్రాలను ఉపయోగిస్తాయి. PCR నిర్వహించి ఫలితాన్ని పరిశీలించడం తుది పరీక్షగానే ఉంటుంది.

తరచుగా అడిగే ప్రశ్నలు

DNA అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత అంటే ఏమిటి?

PCR సమయంలో DNA ప్రైమర్లు టెంప్లేట్ స్ట్రాండ్‌పై తమకు సరిపోలే సీక్వెన్స్‌కు బంధించే ఉష్ణోగ్రత ఇది. ప్రయోగశాలలు సాధారణంగా ప్రైమర్‌కు లెక్కించిన ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రత (Tm) కంటే కొన్ని డిగ్రీలు తక్కువగా దీనిని నిర్ణయిస్తాయి.

ప్రైమర్ Tmను ఎలా లెక్కిస్తారు?

14 బేస్‌లు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ ఉన్న ప్రైమర్లకు, Tm = 64.9 + 41 × (GC లెక్క − 16.4) / పొడవు. 14 బేస్‌ల కంటే చిన్న ప్రైమర్లకు, Tm = 2 × (A+T లెక్క) + 4 × (G+C లెక్క).

GC కంటెంట్ Tmను ఎందుకు పెంచుతుంది?

G-C బేస్ జతలు మూడు హైడ్రోజన్ బంధాలను ఏర్పరుస్తాయి; A-T జతలు రెండు మాత్రమే ఏర్పరుస్తాయి. G, C బేస్‌ల వాటా ఎక్కువగా ఉన్న ప్రైమర్‌ను దాని లక్ష్యం నుంచి వేరు చేయడానికి ఎక్కువ శక్తి, అందువల్ల ఎక్కువ ఉష్ణోగ్రత అవసరం.

PCR అనీలింగ్ ఉష్ణోగ్రత లెక్కించిన Tmకు సమానంగా ఉండాలా?

లేదు. లెక్కించిన Tm కంటే అనేక డిగ్రీలు తక్కువగా చాలా ప్రోటోకాల్‌లు ప్రారంభమవుతాయి, ఆపై అక్కడి నుంచి సర్దుబాటు చేస్తాయి; ఎందుకంటే Tm అనేది ప్రైమర్‌లో సగం మాత్రమే బంధించబడి ఉండే బిందువును సూచిస్తుంది.

ప్రైమర్ పొడవు Tmను మారుస్తుందా?

అవును, అయితే ఇది సరళమైన విధంగా జరగదు. మార్మర్-డోటీ సూత్రంలో పొడవు హారంలో ఉంటుంది; అందువల్ల సగటు GC కంటెంట్ ఉన్న పొడవైన ప్రైమర్‌కు, GC అధికంగా ఉన్న చిన్న ప్రైమర్ కంటే Tm తప్పనిసరిగా ఎక్కువగా ఉండదు.

వేర్వేరు Tm కాలిక్యులేటర్‌లు ఎందుకు ఏకీభవించవు?

అవి వేర్వేరు సూత్రాలను ఉపయోగిస్తాయి. వాలెస్ నియమం, మార్మర్-డోటీ GC-కంటెంట్ సూత్రం, నైయర్‌స్ట్-నెయిబర్ థర్మోడైనమిక్స్, ఉప్పు-సర్దుబాటు సూత్రాలు ఒకే ప్రైమర్‌కు వేర్వేరు Tm విలువలను ఇవ్వవచ్చు; కొన్నిసార్లు ఆ విలువల మధ్య అనేక డిగ్రీల తేడా ఉంటుంది.

సూచనలు

1. Marmur J, Doty P. డీఆక్సిరైబోన్యూక్లియిక్ ఆమ్లం ఉష్ణ డీనేచరేషన్ ఉష్ణోగ్రత ఆధారంగా దాని బేస్ కూర్పు నిర్ణయం. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. సింథటిక్ ఒలిగోడీఆక్సిరైబోన్యూక్లియోటైడ్‌లను ఫై చై 174 DNAతో హైబ్రిడైజేషన్. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. పాలిమర్, డంబ్‌బెల్ మరియు ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ DNA యొక్క సమీప-పొరుగు థర్మోడైనమిక్స్‌పై ఏకీకృత దృక్కోణం. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.