Máy Tính Pha Loãng Tế Bào - Công Cụ Pha Loãng Chính Xác Trong Phòng Thí Nghiệm

Máy tính độ pha loãng tế bào

Máy tính độ pha loãng tế bào xác định lượng huyền phù tế bào và lượng chất pha loãng cần trộn để đạt nồng độ tế bào mục tiêu trong một thể tích cuối đã chọn. Công cụ này được dùng trong nuôi cấy tế bào, vi sinh học và các công việc phòng thí nghiệm khác, khi mẫu phải được đưa về nồng độ chính xác trước khi sử dụng.

Độ pha loãng tế bào là gì

Pha loãng huyền phù tế bào không làm thay đổi số lượng tế bào mà nó chứa. Quá trình này chỉ thay đổi thể tích chất lỏng chứa tế bào, từ đó làm giảm nồng độ. Một huyền phù được đếm ở mức 1.000.000 tế bào trên mỗi mililit (tế bào/mL) vẫn chứa cùng tổng số tế bào sau khi pha loãng. Số tế bào đó chỉ được phân bố trong một lượng chất lỏng lớn hơn.

Phòng thí nghiệm pha loãng tế bào trước nhiều bước thường quy: chia một nuôi cấy đang phát triển sang các bình nuôi cấy mới, gieo một số lượng tế bào cố định vào từng giếng của đĩa, đông lạnh tế bào để lưu trữ, hoặc chuẩn bị mẫu cho máy đếm tế bào hay máy đo dòng chảy tế bào.

Công thức pha loãng tế bào

Phép tính dựa trên một quy tắc. Số tế bào lấy từ huyền phù gốc, nhân với nồng độ của nó, phải bằng số tế bào trong thể tích cuối, nhân với nồng độ mục tiêu:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — nồng độ ban đầu (huyền phù gốc), tính bằng tế bào/mL
• V₁ — thể tích huyền phù gốc cần sử dụng, tính bằng mL
• C₂ — nồng độ mục tiêu, tính bằng tế bào/mL
• V₂ — tổng thể tích cuối cần có, tính bằng mL

Giải theo V₁ sẽ cho thể tích huyền phù gốc cần hút bằng pipet:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Phần còn lại của thể tích cuối là chất pha loãng, thường là môi trường nuôi cấy tế bào, dung dịch muối đệm phosphate (PBS) hoặc một dung dịch đệm khác:

Thể tích chất pha loãng = V₂ − V₁

Nồng độ mục tiêu (C₂) không bao giờ được cao hơn nồng độ huyền phù gốc (C₁). Pha loãng chỉ làm giảm nồng độ. Muốn tăng nồng độ, cần ly tâm tế bào rồi huyền phù lại trong một lượng chất lỏng nhỏ hơn.

Cách tính độ pha loãng tế bào

1. Đếm huyền phù gốc bằng buồng đếm tế bào hoặc máy đếm tế bào tự động để xác định C₁.
2. Ghi lại nồng độ mục tiêu, C₂, theo yêu cầu của quy trình.
3. Xác định tổng thể tích cuối cần có, V₂.
4. Tính V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Tính thể tích chất pha loãng bằng V₂ − V₁.
6. Dùng pipet hút V₁ huyền phù gốc vào ống, sau đó thêm thể tích môi trường hoặc dung dịch đệm làm chất pha loãng.

Ví dụ minh họa

Một huyền phù gốc được đếm ở mức 1.000.000 tế bào/mL. Một quy trình yêu cầu 100.000 tế bào/mL trong thể tích cuối là 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Thể tích chất pha loãng = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Lấy 1 mL huyền phù gốc và thêm 9 mL môi trường sẽ tạo ra 10 mL huyền phù có nồng độ 100.000 tế bào/mL.

Ví dụ thứ hai

Một phép thử trên đĩa 96 giếng cần 10.000 tế bào mỗi giếng trong 200 microlit (μL) môi trường mỗi giếng. Nồng độ mục tiêu là 50.000 tế bào/mL, vì 10.000 tế bào chia cho 0,2 mL bằng 50.000 tế bào/mL. Huyền phù gốc được đếm ở mức 2.000.000 tế bào/mL và cần tổng cộng 20 mL để đủ cho đĩa, có thêm một phần dự phòng cho hao hụt khi hút bằng pipet.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Thể tích chất pha loãng = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Trộn 0,5 mL huyền phù gốc với 19,5 mL môi trường sẽ tạo ra 20 mL có nồng độ 50.000 tế bào/mL, tương đương độ pha loãng 1 trên 40.

Các nguồn sai số

Bản thân công thức là chính xác. Sai số phát sinh từ các con số được đưa vào công thức.

• Sai số đếm. Đếm sai số lượng tế bào sẽ trực tiếp dẫn đến pha loãng sai. Đếm cả bốn ô vuông ở các góc của lưới buồng đếm tế bào rồi lấy giá trị trung bình sẽ giảm rủi ro này.
• Tế bào kết cụm. Một cụm tế bào trông giống như một tế bào dưới kính hiển vi nhưng thực tế gồm nhiều tế bào, nên làm giảm nồng độ biểu kiến.
• Khoảng thể tích của pipet. Pipet được sử dụng ngoài khoảng thể tích định mức sẽ cho kết quả không chính xác. Pipet 1000 μL được đặt để phân phối 5 μL không đáng tin cậy; nên dùng pipet nhỏ hơn.
• Nhầm lẫn đơn vị. Trộn lẫn tế bào/mL với tế bào/μL tạo ra sai số lớn hơn hoặc nhỏ hơn thực tế một nghìn lần.
• Tế bào chết. Việc đếm tế bào thô bao gồm cả tế bào chết, trừ khi đã sử dụng thuốc nhuộm đánh giá khả năng sống, chẳng hạn như xanh trypan. Điều này có thể làm tăng quá mức số tế bào sống thực sự có mặt.

Giới hạn của máy tính này

Máy tính từ chối những con số không thể cho ra kết quả hữu ích:

• Mọi giá trị phải lớn hơn không.
• Nồng độ mục tiêu không thể cao hơn nồng độ ban đầu.
• Nồng độ ban đầu phải bằng hoặc thấp hơn 1 nghìn tỷ tế bào/mL (1 × 10¹²).
• Thể tích huyền phù gốc được tính ra phải ít nhất là 0,001 mL, tương đương 1 microlit. Không thể hút chính xác thể tích nhỏ hơn, nên máy tính yêu cầu các con số khác. Tăng tổng thể tích thường sẽ khắc phục được vấn đề này.

Các thể tích được hiển thị với hai chữ số thập phân, hoặc ba chữ số khi thể tích huyền phù gốc nhỏ hơn 0,01 mL, để một thể tích nhỏ không bao giờ hiển thị thành 0,00 mL.

Các câu hỏi thường gặp

Công thức pha loãng tế bào là gì?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, trong đó C₁ và C₂ là nồng độ ban đầu và nồng độ mục tiêu, còn V₁ và V₂ là thể tích lấy từ huyền phù gốc và tổng thể tích cuối.

Nồng độ mục tiêu có thể cao hơn nồng độ ban đầu không?

Không. Pha loãng chỉ làm giảm nồng độ. Muốn đạt nồng độ cao hơn, cần ly tâm tế bào và huyền phù lại trong một thể tích nhỏ hơn.

Nên dùng chất lỏng nào để pha loãng tế bào?

Dùng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh khi tế bào cần tiếp tục sống khỏe trong nhiều giờ hoặc nhiều ngày, chẳng hạn trước khi gieo vào đĩa. PBS hoặc dung dịch muối đệm tương tự phù hợp cho việc pha loãng ngắn, dưới khoảng 30 phút, trước khi xử lý tế bào tiếp. Dùng môi trường không huyết thanh khi protein huyết thanh có thể gây ảnh hưởng đến phép thử tiếp theo.

Công thức này có áp dụng cho vi khuẩn hoặc nấm men không?

Có. C₁V₁ = C₂V₂ áp dụng cho mọi huyền phù hạt, bao gồm vi khuẩn được đo bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi mililit (CFU/mL), nấm men và các hạt virus được đo bằng đơn vị hình thành mảng trên mỗi mililit (PFU/mL), miễn là hai vế của phương trình sử dụng cùng đơn vị.

Có nên tính tế bào chết khi pha loãng không?

Khi gieo một nuôi cấy sống, chỉ nên tính các tế bào còn sống. Nếu một huyền phù có khả năng sống là 80%, nồng độ tế bào sống của nó bằng 0,8 lần tổng số tế bào, và nên dùng nồng độ tế bào sống đó làm C₁.

Làm thế nào để thực hiện chính xác các độ pha loãng rất lớn?

Các độ pha loãng lớn, chẳng hạn 1 trên 1000, thường được thực hiện qua một chuỗi bước nhỏ hơn gọi là pha loãng nối tiếp. Ba lần pha loãng liên tiếp theo tỷ lệ 1 trên 10 đạt độ pha loãng tổng thể là 1 trên 1000, đồng thời giữ cho mỗi bước hút bằng pipet nằm trong khoảng thể tích có độ chính xác phù hợp.