Máy Tính Pha Loãng Nối Tiếp - Công Cụ Nồng Độ Phòng Thí Nghiệm

Máy tính pha loãng nối tiếp xác định nồng độ của một chất ở mỗi bước trong một dãy pha loãng. Pha loãng nối tiếp là kỹ thuật phòng thí nghiệm làm giảm nồng độ của dung dịch theo một chuỗi bước bằng nhau, trong đó mỗi bước mới pha loãng bước trước đó theo cùng một hệ số.

Pha loãng nối tiếp là gì?

Pha loãng nối tiếp giải quyết một vấn đề phổ biến trong phòng thí nghiệm: mẫu quá đậm đặc để đo hoặc sử dụng trực tiếp. Thay vì cố đo một thể tích rất nhỏ, dễ gây sai số trong một bước duy nhất, nhà khoa học pha loãng mẫu nhiều lần liên tiếp, sử dụng một thể tích nhỏ và dễ thao tác ở mỗi bước.

Mỗi lần pha loãng bắt đầu từ kết quả của lần trước đó, không phải từ mẫu ban đầu. Nhờ vậy hình thành một dãy nồng độ giảm theo cùng một hệ số sau mỗi lần. Kỹ thuật này được dùng để đếm vi khuẩn, kiểm tra ảnh hưởng của thuốc lên tế bào ở các liều khác nhau, lập đường chuẩn cho các phép thử trong phòng thí nghiệm và chuẩn bị mẫu DNA cho PCR.

Công thức pha loãng nối tiếp

Mỗi bước pha loãng tuân theo công thức sau:

$C_2 = \frac{C_1}{DF}$

• C₁ là nồng độ trước bước đó
• DF là hệ số pha loãng
• C₂ là nồng độ sau bước đó

Để xác định nồng độ sau nhiều bước cùng một lúc, dùng:

$C_n = \frac{C_0}{DF^n}$

• C₀ là nồng độ ban đầu
• DF là hệ số pha loãng
• n là số bước
• C_n là nồng độ sau n bước

Hệ số pha loãng phải lớn hơn 1. Hệ số 1 có nghĩa là hoàn toàn không pha loãng. Nồng độ ban đầu phải lớn hơn 0.

Máy tính này nhận từ 1 đến 20 bước và liệt kê bước 0, tức mẫu chưa pha loãng, cùng với các bước đó. Đơn vị nồng độ là nhãn văn bản thuần túy, chẳng hạn như mg/mL hoặc CFU/mL, và mọi hàng đều được báo cáo theo cùng đơn vị đó. Nồng độ được hiển thị với sáu chữ số có nghĩa; các giá trị dưới 0,000001 được chuyển sang dạng ký hiệu khoa học để kết quả nhỏ không bao giờ hiển thị thành số 0.

Hệ số pha loãng và tỷ lệ pha loãng

Hệ số pha loãng 10 thường được viết dưới dạng tỷ lệ 1:10. Tỷ lệ mô tả các phần, không phải bản thân hệ số: 1 phần mẫu cộng với 9 phần dung môi pha loãng tạo thành tổng cộng 10 phần. Hệ số cho biết dung dịch mới loãng hơn bao nhiêu lần, vì vậy tỷ lệ 1:10 tương ứng với hệ số pha loãng 10, không phải 11.

Các hệ số pha loãng thường dùng gồm:

• 10 (1:10): lựa chọn tiêu chuẩn trong vi sinh học vì bao phủ khoảng nồng độ rộng chỉ với vài bước.
• 2 (1:2): thường dùng trong dược lý học, khi cần các bước nhỏ hơn để vẽ đường cong liều–đáp ứng.
• 5 (1:5): lựa chọn trung gian, cho nhiều điểm dữ liệu hơn 1:10 mà không cần nhiều bước như 1:2.

Ví dụ: Pha loãng nuôi cấy vi khuẩn

Một mẫu nuôi cấy lỏng chứa ước tính 10⁸ đơn vị tạo khuẩn lạc (CFU) trên mỗi mililit, quá đậm đặc để đếm trực tiếp. Việc đếm cần từ 30 đến 300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa, vì vậy mẫu cần một dãy 1:10 với 6 bước.

Cấy 100 μL (0,1 mL) từ bước 5 sẽ đưa khoảng 10² = 100 CFU lên đĩa, nằm trong khoảng có thể đếm được.

Ví dụ: Dãy pha loãng thuốc hai lần

Một loại thuốc được dự đoán có IC50 (nồng độ làm giảm một nửa hoạt tính) gần 25 mg/mL. Việc kiểm tra một khoảng quanh giá trị đó cần một dãy 1:2 bắt đầu từ 100 mg/mL với 5 bước.

Dãy này bao quanh giá trị IC50 dự kiến và cung cấp đủ điểm để vẽ đường cong đáp ứng liều.

Cách thực hiện pha loãng nối tiếp

1. Ghi nhãn mỗi ống bằng số bước và hệ số pha loãng trước khi bắt đầu.
2. Thêm dung môi pha loãng vào mọi ống, trừ ống chứa mẫu ban đầu. Với dãy 1:10, thêm 9 thể tích dung môi pha loãng vào 1 thể tích sẽ chứa mẫu.
3. Chuyển một thể tích mẫu ban đầu đã được đo vào ống thứ nhất và trộn kỹ, bằng cách vortex hoặc hút nhả bằng pipet nhiều lần.
4. Dùng đầu típ mới, chuyển cùng thể tích từ ống thứ nhất sang ống thứ hai rồi trộn lại.
5. Lặp lại bước chuyển và trộn cho từng ống còn lại.
6. Sử dụng các mẫu đã pha loãng ngay, vì tế bào sống tiếp tục phát triển và một số hợp chất bị phân hủy theo thời gian.

Ứng dụng của pha loãng nối tiếp

Vi sinh học sử dụng pha loãng nối tiếp để đếm khuẩn lạc trên đĩa và kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), tức xác định liều kháng sinh thấp nhất ngăn vi khuẩn phát triển. Hóa sinh học sử dụng kỹ thuật này để lập đường chuẩn cho các phép thử protein và chuẩn bị khuôn DNA cho PCR ở nồng độ có thể thao tác. Dược lý học sử dụng các dãy pha loãng để kiểm tra thuốc trên nhiều mức liều và tính các giá trị như IC50. Miễn dịch học sử dụng kỹ thuật này để lập đường chuẩn ELISA và chuẩn độ kháng thể, qua đó xác định độ pha loãng cao nhất vẫn cho kết quả dương tính.

Các lỗi thường gặp

Trộn từng ống không kỹ là một nguồn sai số thường gặp, vì các hạt và tế bào có thể lắng xuống thay vì phân bố đồng đều. Việc tái sử dụng đầu típ pipet có thể mang theo đủ vật chất từ một ống đậm đặc hơn để làm sai lệch các phép đo sau đó. Nhầm lẫn giữa tỷ lệ pha loãng và hệ số pha loãng dẫn đến sử dụng sai thể tích: pha loãng 1:10 có nghĩa là 1 phần mẫu cộng với 9 phần dung môi pha loãng, không phải 1 phần cộng với 10. Việc làm tròn nồng độ ở mỗi bước thay vì tính trực tiếp giá trị cuối cùng từ C₀/DF^n có thể tích lũy sai số đáng kể qua nhiều bước.

Lịch sử

Robert Koch đã phát triển các phương pháp định lượng để đếm khuẩn lạc vào những năm 1880 khi nghiên cứu bệnh lao và bệnh tả, đặt nền móng cho phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa vẫn được sử dụng ngày nay. Micropipet đệm khí, được Heinrich Schnitger phát minh vào năm 1957, sau đó cho phép các nhà nghiên cứu đo chính xác thể tích microlit, giúp các dãy pha loãng tinh và có độ lặp lại cao trở nên khả thi trong sinh học phân tử và xét nghiệm miễn dịch.

Các câu hỏi thường gặp

Tính pha loãng nối tiếp như thế nào? Dùng C_n = C₀ / DF^n, trong đó C₀ là nồng độ ban đầu, DF là hệ số pha loãng và n là số bước. Ví dụ, 100 mg/mL được pha loãng với hệ số 10 qua 3 bước sẽ cho 100 / 10³ = 0,1 mg/mL.

Sự khác nhau giữa hệ số pha loãng và tỷ lệ pha loãng là gì? Tỷ lệ pha loãng, chẳng hạn như 1:10, mô tả các phần: 1 phần mẫu kết hợp với 9 phần dung môi pha loãng tạo thành tổng cộng 10 phần. Hệ số pha loãng chính là số 10, có nghĩa là dung dịch có nồng độ thấp hơn mười lần.

Tại sao nên dùng nhiều bước pha loãng nhỏ thay vì một bước pha loãng lớn? Các lần chuyển thể tích nhỏ và bằng nhau dễ hút chính xác bằng pipet hơn một lần pha loãng rất lớn. Một dãy gồm sáu bước 1:10 cũng đạt độ pha loãng một triệu lần, một khoảng khó đạt chính xác chỉ trong một bước.

Pha loãng nối tiếp chính xác đến mức nào? Với pipet đã hiệu chuẩn và thao tác cẩn thận, một dãy thường có độ chính xác trong khoảng từ 5 đến 10 phần trăm, phù hợp với hầu hết công việc vi sinh học. Các ứng dụng cần độ chính xác cao hơn, chẳng hạn như các tiêu chuẩn dược phẩm, thường sử dụng các phép pha loãng song song được tạo trực tiếp từ dung dịch gốc.

Số bước pha loãng tối đa có ích là bao nhiêu? Máy tính này cho phép tối đa 20 bước. Hầu hết quy trình phòng thí nghiệm sử dụng từ 6 đến 10 bước, vì sai số tăng lên sau mỗi lần chuyển. Hệ số pha loãng lớn hơn làm giảm số bước cần thiết; chẳng hạn, ba bước 1:100 đạt độ pha loãng 10⁻⁶ giống như sáu bước 1:10.

Hệ số pha loãng có thể thay đổi giữa các bước trong cùng một dãy không? Có, nhưng hầu hết quy trình giữ hệ số không đổi vì một hệ số cố định dễ tính toán, hút bằng pipet và tái lập hơn. Đôi khi người ta sử dụng dãy có hệ số thay đổi khi một phần của khoảng nồng độ cần độ phân giải cao hơn phần khác.