Калкулатор за ензимна активност - Михаелис-Ментен кинетика

Калкулатор за ензимна активност

Калкулаторът за ензимна активност определя с каква скорост ензимът превръща субстрата в продукт, изразена като специфична активност — в единици на милиграм (U/mg). Той използва уравнението на Михаелис–Ментен, стандартния модел за ензимна кинетика, заедно с количеството ензимен белтък в пробата.

Ензимите са белтъци, които ускоряват химичните реакции в клетките, без да се изразходват. Учените измерват активността на ензима, за да сравняват различни партиди, да проверяват дали даден етап на пречистване е успешен или да изследват как дадено лекарство влияе на скоростта на ензима. Самото число за концентрацията на ензима не показва дали той изпълнява функцията си. Това показва специфичната активност.

Какво изчислява калкулаторът

Инструментът приема пет входни стойности: концентрация на ензима, концентрация на субстрата, константата на Михаелис (Km), максималната скорост (Vmax) и време на реакцията. Времето на реакцията се записва за справка, но не участва във формулата, защото Vmax вече е скорост: количество субстрат, превърнато за минута. Времето вече е вградено в нея. Ако се дели отново на времето, то би се отчело два пъти.

Калкулаторът връща:

• Специфична активност в U/mg, показана с четири знака след десетичната запетая: скоростта на реакцията, разделена на количеството на наличния ензимен белтък
• Диаграма на скоростта на реакцията спрямо концентрацията на субстрата, от нула до три пъти въведената концентрация на субстрата, като въведената стойност е отбелязана с точка

Как се изчислява ензимната активност

Уравнението на Михаелис–Ментен

Леонор Михаелис и Мод Ментен публикуват този модел през 1913. Той описва как скоростта на реакцията на един ензим зависи от концентрацията на субстрата:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = скорост на реакцията при дадена концентрация на субстрата
• $V_{max}$ = максималната скорост — скоростта, при която ензимът е напълно наситен със субстрат
• $[S]$ = концентрация на субстрата
• $K_m$ = константата на Михаелис: концентрацията на субстрата, при която скоростта е половината от Vmax

Формула за специфична активност

Специфичната активност се получава, като тази скорост се раздели на количеството наличен ензимен белтък, което дава резултат в единици на милиграм (U/mg):

$\text{Специфична активност} = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

$[E]$ е концентрацията на ензима в mg/mL. Една ензимна единица (U) е количеството ензим, което превръща 1 микромол (µmol) субстрат за минута. Тази единица се използва широко в биохимията и медицината от 1964 година. Тъй като Vmax се въвежда в µmol/min, тя вече съдържа това „за минута“. Във формулата не се появява отделен член за времето.

Това изчисление предполага, че измерената скорост е начална скорост, взета в началото на реакцията, преди субстратът да намалее или продуктът да започне да инхибира ензима. Самите Михаелис и Ментен са използвали измервания на началната скорост, за да избегнат влиянието на продуктите на реакцията.

Примери за изчисление

Пример 1. Концентрация на ензима 1 мг/mL, концентрация на субстрата 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/min.

Скорост = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/min Специфична активност = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg (калкулаторът показва 33,3333)

Това са стойностите по подразбиране на калкулатора.

Пример 2. Същите условия, но концентрацията на ензима е удвоена до 2 мг/mL.

Скорост = 33,33 µmol/min (непроменена, тъй като скоростта не зависи от [E] в това уравнение) Специфична активност = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Удвояването на количеството ензим намалява наполовина специфичната активност, защото същата обща скорост вече се разпределя върху два пъти повече белтък.

Пример 3. Субстратът е повишен до 100 mM, значително над Km, при концентрация на ензима 1 мг/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/min.

Скорост = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/min Специфична активност = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

При висока концентрация на субстрата ензимът е почти наситен, така че скоростта е близка до Vmax.

Пример 4. Субстратът е намален до 1 mM, под Km, при концентрация на ензима 1 мг/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/min.

Скорост = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/min Специфична активност = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Под Km малкото количество субстрат ограничава реакцията, затова и скоростта, и специфичната активност са значително по-ниски от Vmax.

Обяснение на основните параметри

Концентрацията на ензима [E] е масата на ензимния белтък на единица обем, в mg/mL. По-високата стойност разпределя същата скорост на реакцията върху повече белтък и понижава специфичната активност. Именно специфичната активност, а не концентрацията сама по себе си, показва дали даден ензимен препарат работи добре.

Концентрацията на субстрата [S] показва с какво количество субстрат разполага ензимът, обикновено в mM. При ниска [S] малките увеличения рязко повишават скоростта. Близо до насищане допълнителният субстрат почти не помага.

Константата на Михаелис (Km) е концентрацията на субстрата, при която скоростта е равна на половината от Vmax. Ниска Km означава, че ензимът достига половин скорост при ниска концентрация на субстрата, признак за силно свързване между ензима и субстрата.

Максималната скорост (Vmax) е скоростта, когато субстратът вече не е ограничаващ. Тя зависи от количеството на наличния ензим и от това колко бързо всяка ензимна молекула може да превръща субстрата (нейното число на оборот, kcat).

Времето на реакцията е колко дълго е протекъл анализът. Полезно е за планиране на експеримент, защото реакция, оставена да тече твърде дълго, може да изчерпи субстрата и да престане да се държи линейно. То не е част от самата формула за специфичната активност.

Как се разчита кривата на скоростта

Диаграмата изобразява скоростта спрямо концентрацията на субстрата по уравнението на Михаелис–Ментен, от нула до три пъти въведената концентрация на субстрата.

• Под Km: скоростта нараства приблизително пропорционално на субстрата. Малки грешки в концентрацията на субстрата водят до големи грешки в резултата.
• Близо до Km: кривата се огъва. Скоростта е равна на половината от Vmax.
• Над Km: кривата се изравнява. Допълнителният субстрат добавя малко към скоростта, защото ензимът е почти наситен.

Защо специфичната активност е важна

Специфичната активност е стандартна мярка за чистотата и качеството на ензима. По време на пречистването учените я следят на всеки етап. Суровият клетъчен екстракт има ниска специфична активност, която нараства с пречистването на ензима. Нарастващата специфична активност по време на пречистване показва, че неактивният белтък се отстранява, докато търсеният ензим се запазва.

Същото измерване подпомага разработването на лекарства, при което изследователите проверяват как кандидатните съединения понижават активността на ензима, както и клиничната диагностика, при която лекарите измерват ензими като ALT и AST в кръвта, за да проверят за увреждане на черния дроб.

Често задавани въпроси

Как се изчислява ензимната активност от Km и Vmax? Първо се намира скоростта на реакцията с уравнението на Михаелис–Ментен, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). След това се дели на концентрацията на ензима, за да се получи специфичната активност в U/mg: Активност = v / [E].

Какво представлява една единица (U) ензимна активност? Една единица е количеството ензим, което при определени условия превръща 1 µmol субстрат за минута, съгласно определението на IUBMB.

Защо формулата не включва времето на реакцията? Vmax вече е изразена като количество за минута, тоест представлява скорост, а не общо количество. Повторното делене на време би го отчело два пъти и би направило резултата зависим от продължителността на анализа, което не би трябвало да се случва за свойство на самия ензим.

Защо специфичната активност намалява, когато концентрацията на ензима се увеличи? Скоростта в уравнението на Михаелис–Ментен не зависи от концентрацията на ензима. Специфичната активност разделя тази постоянна скорост на [E], така че по-голямо [E] дава по-малък резултат. Сравняването на специфичната активност, а не на самата скорост, позволява справедливо сравнение на ензимни препарати с различни концентрации.

Какво означава ниска Km? Ниска Km означава, че ензимът достига половината от максималната си скорост при ниска концентрация на субстрата, което показва, че ензимът и субстратът се свързват здраво.

Може ли специфичната активност да е отрицателна? Не. Калкулаторът връща 0, когато концентрацията на ензима е нула или по-малка, или когато концентрацията на субстрата, Km или Vmax са отрицателни. Отрицателна стойност би сочила грешка във входните данни, а не реално измерване на ензим.

Източници

1. Johnson, K. A., & Goody, R. S. (2011). The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry 50(39). Пълен текст в PubMed Central — публикацията от 1913 и използването в нея на измервания на началната скорост.
2. IUBMB. Symbolism and Terminology in Enzyme Kinetics, sections 4–6. Ензимни реакции с един субстрат — константата на Михаелис е концентрацията на субстрата, при която v = 0,5 В.
3. BIPM. Resolution 12 of the 21st CGPM (1999). Специално име за производната единица на SI мол за секунда, катал — ензимната единица U е равна на 1 µmol/min и се използва от 1964 година.