Калкулатор за ензимна активност - Михаелис-Ментен кинетика

Калкулатор за ензимна активност

Калкулаторът за ензимна активност определя с каква скорост ензимът превръща субстрата в продукт, изразена като специфична активност — в единици на милиграм (U/mg). Той използва уравнението на Михаелис–Ментен, стандартния модел за ензимна кинетика, заедно с количеството ензимен белтък в пробата.

Ензимите са белтъци, които ускоряват химичните реакции в клетките, без да се изразходват. Учените измерват активността на ензима, за да сравняват различни партиди, да проверяват дали даден етап на пречистване е успешен или да изследват как дадено лекарство влияе на скоростта на ензима. Самото число за концентрацията на ензима не показва дали той изпълнява функцията си. Това показва специфичната активност.

Какво изчислява калкулаторът

Инструментът приема пет входни стойности: концентрация на ензима, концентрация на субстрата, константа на Михаелис (Km), максимална скорост (Vmax) и време на реакцията. Времето на реакцията се записва за справка, но не участва във формулата. Vmax вече е скорост — количество субстрат, превърнато за минута, — така че времето е включено в нея. Повторното делене на време би го отчело два пъти.

Калкулаторът връща едно число и една графика:

• Специфична активност, в U/mg. Това е скоростта на реакцията, разделена на количеството наличен ензимен белтък.
• Графика на скоростта на реакцията спрямо концентрацията на субстрата, показваща ниската, преходната и наситената част на кривата. На нея е отбелязана скоростта при въведената концентрация на субстрата.

Как се изчислява ензимната активност

Уравнението на Михаелис–Ментен

Леонор Михаелис и Мауд Ментен публикуват този модел през 1913. Той описва как скоростта на ензимната реакция зависи от концентрацията на субстрата:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = скорост на реакцията при дадена концентрация на субстрата
• $V_{max}$ = максималната скорост — скоростта, при която ензимът е напълно наситен със субстрат
• $[S]$ = концентрация на субстрата
• $K_m$ = константа на Михаелис: концентрацията на субстрата, при която скоростта е половината от Vmax

Формула за специфична активност

Специфичната активност се получава, като тази скорост се раздели на количеството наличен ензимен белтък, което дава резултат в единици на милиграм (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Тук $A$ е специфичната активност, а $[E]$ — концентрацията на ензима.

Една ензимна единица (U) е количеството ензим, което превръща 1 микромол (µmol) субстрат за минута. Това определение е установено от Международния съюз по биохимия и молекулярна биология (IUBMB).

Единиците се подреждат по следния начин. В уравнението на Михаелис–Ментен скоростта има единици концентрация на субстрата, разделена на време. Калкулаторът приема [S] и Km в mM, затова Vmax и v са в µmol за минута на милилитър, записано като µmol/(min·mL). Това е същото като mM/min и като U/mL. Концентрацията на ензима [E] е в mg/mL. При делението милилитрите се съкращават:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax вече съдържа „за минута“, затова във формулата не се включва отделен член за време.

Това изчисление предполага, че измерената скорост е начална скорост, определена в началото на реакцията, преди субстратът да се изчерпи значително или продуктът да започне да потиска ензима. В лабораториите обикновено се измерват първите 5–10% от превръщането на субстрата, за да се запази този линеен диапазон.

Пример с решение

Пример 1. Концентрация на ензима 1 мг/mL, концентрация на субстрата 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Това са началните стойности на калкулатора.

Скорост = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Специфична активност = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Пример 2. Същите условия, но концентрацията на ензима е удвоена до 2 мг/mL.

Скорост = 33,33 µmol/(min·mL), непроменена, тъй като в това уравнение скоростта не зависи от [E]. Специфична активност = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Удвояването на количеството ензим намалява наполовина специфичната активност, защото същата обща скорост вече се разпределя върху два пъти повече белтък.

Пример 3. Концентрацията на субстрата е увеличена до 100 mM, значително над Km, при концентрация на ензима 1 мг/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL).

Скорост = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Специфична активност = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

При висока концентрация на субстрата ензимът е почти наситен, така че скоростта е близка до Vmax.

Пример 4. Концентрацията на субстрата е намалена до 1 mM, под Km, при концентрация на ензима 1 мг/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL).

Скорост = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Специфична активност = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Под Km малкото количество субстрат ограничава реакцията, затова и скоростта, и специфичната активност са значително по-ниски от Vmax.

Обяснение на основните параметри

Концентрацията на ензима [E] е масата на ензимния белтък на единица обем, в mg/mL. По-високата стойност разпределя същата скорост на реакцията върху повече белтък и понижава специфичната активност. Именно специфичната активност, а не концентрацията сама по себе си, показва дали даден ензимен препарат работи добре.

Концентрацията на субстрата [S] показва с какво количество субстрат разполага ензимът, обикновено в mM. При ниска [S] малките увеличения рязко повишават скоростта. Близо до насищане допълнителният субстрат почти не помага.

Константата на Михаелис (Km) е концентрацията на субстрата, при която скоростта е равна на половината от Vmax. Ниска Km означава, че ензимът достига половината от максималната си скорост при ниска концентрация на субстрата, което показва силно свързване между ензима и субстрата. Например хексокиназата има Km около 0,1 mM за глюкоза, което показва висок афинитет.

Максималната скорост (Vmax) е скоростта, когато субстратът вече не ограничава реакцията. Въведете я в µmol/(min·mL), което е същото като mM/min или U/mL, така че да съответства на mM, използвани за [S] и Km. Тя зависи от количеството ензим и от скоростта, с която всяка ензимна молекула превръща субстрата (каталитичното число на ензима, kcat).

Времето на реакцията е продължителността на анализа. То помага при планирането на експеримент, тъй като прекалено дълго протичаща реакция може да изчерпи субстрата и да престане да се държи линейно. То не е част от самата формула за специфична активност.

Как се разчита кривата на скоростта

На графиката е нанесена скоростта спрямо концентрацията на субстрата чрез уравнението на Михаелис–Ментен.

• Под Km: скоростта нараства приблизително пропорционално на субстрата. Малки грешки в концентрацията на субстрата водят до големи грешки в резултата.
• Близо до Km: кривата се огъва. Скоростта е равна на половината от Vmax.
• Над Km: кривата се изравнява. Допълнителният субстрат добавя малко към скоростта, защото ензимът е почти наситен.

Защо специфичната активност е важна

Специфичната активност е стандартен показател за чистотата и качеството на ензима. По време на пречистване учените я проследяват на всеки етап: суров клетъчен екстракт може да покаже няколко U/mg, докато силно пречистена проба може да достигне стотици или хиляди U/mg. Нарастването на специфичната активност по време на пречистването показва, че неактивният белтък се отстранява, а търсеният ензим се запазва.

Същото измерване подпомага разработването на лекарства, при което изследователите проверяват как кандидатните съединения понижават активността на ензима, както и клиничната диагностика, при която лекарите измерват ензими като ALT и AST в кръвта, за да проверят за увреждане на черния дроб.

Често задавани въпроси

Как се изчислява ензимната активност по Km и Vmax? Първо намерете скоростта на реакцията с уравнението на Михаелис–Ментен, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). След това разделете на концентрацията на ензима, за да получите специфичната активност в U/mg: Активност = v / [E]. Поддържайте Vmax в µmol/(min·mL), а [E] в mg/mL, така че единиците да се съкратят до U/mg.

Какво представлява една единица (U) ензимна активност? Една единица е количеството ензим, което при определени условия превръща 1 µmol субстрат за минута, съгласно определението на IUBMB.

Защо формулата не включва времето на реакцията? Vmax вече е изразена като количество за минута, тоест представлява скорост, а не общо количество. Повторното делене на време би го отчело два пъти и би направило резултата зависим от продължителността на анализа, което не би трябвало да се случва за свойство на самия ензим.

Защо специфичната активност намалява, когато концентрацията на ензима се увеличи? Скоростта в уравнението на Михаелис–Ментен не зависи от концентрацията на ензима. Специфичната активност разделя тази постоянна скорост на [E], така че по-голямо [E] дава по-малък резултат. Сравняването на специфичната активност, а не на самата скорост, позволява справедливо сравнение на ензимни препарати с различни концентрации.

Какво означава ниска Km? Ниска Km означава, че ензимът достига половината от максималната си скорост при ниска концентрация на субстрата, което показва, че ензимът и субстратът се свързват здраво.

Може ли специфичната активност да бъде отрицателна? Не. Отрицателният резултат показва грешка във входните данни, например отрицателна концентрация, или грешка в изчислението, а не реално измерване на ензим.

Източници

1. Михаелис, L., и Ментен, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Берг, J. M., Тимочко, J. L., и Страйър, L. (2012). Biochemistry (7-о изд.). W.H. Freeman и Company.
3. Международен съюз по биохимия и молекулярна биология (IUBMB). Enzyme Nomenclature. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. База данни за ензими BRENDA. https://www.brenda-enzymes.org/