Калкулатор за разтворимост на протеини - Безплатен pH и температурен инструмент

Калкулаторът за разтворимост на протеини оценява най-високата концентрация на протеин, която остава разтворена в разтворител при зададени pH, температура и йонна сила. Той превръща основни химични зависимости в едно число — милиграми протеин на милилитър разтворител.

Разтворимостта на протеините е важна в биохимията, разработването на лекарствени форми и хранителната наука. Протеин, който не остава разтворен, образува агрегати или утайки, което може да провали експеримент или да направи лекарството невъзможно за инжектиране.

Как се изчислява разтворимостта на протеин

Разтворимостта зависи от пет неща: изоелектричната точка на протеина (pH, при което нетният му заряд е нула), точката му на топене (температурата, при която започва да се разгъва), диелектричната константа на разтворителя (мярка за това колко добре разделя заредените частици), pH на разтвора и йонната сила (мярка за количеството разтворена сол).

Калкулаторът започва с известната разтворимост на всеки протеин във вода при референтни условия: 25 °C, pH 7,0 и йонна сила 0,15 M (приблизително нивото на солта в кръвта). След това умножава тази референтна стойност по четири съотношения, по едно за всяко променено условие.

Формула за разтворимост на протеин

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ е известната разтворимост на протеина във вода при референтните условия, в mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, където $pI$ е изоелектричната точка на протеина. Разтворимостта е най-ниска при изоелектричната точка и нараства с отдалечаването на pH от нея, като се стабилизира в рамките на няколко pH единици.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, където $I$ е йонната сила в молове на литър. При ниски нива на сол този член леко повишава разтворимостта („осоляване навътре“). При високи нива на сол той понижава разтворимостта („осоляване навън“).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, където $T_m$ е точката на топене на протеина в °C. Разтворимостта нараства плавно с температурата, а след това рязко спада, когато температурата се приближи до $T_m$ и протеинът започне да се разгъва.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, където $\varepsilon$ е диелектричната константа на разтворителя. Водата има диелектрична константа 78,4, затова този член е равен на 1 във вода. Разтворители, които разделят зарядите по-неефективно от водата, например етанолът, понижават разтворимостта.

Референтни стойности, използвани от калкулатора

Категории на разтворимост

Пример: албумин във фосфатен буфер

Да се намери разтворимостта на албумина във фосфатен буфер при 25 °C, pH 7,4 и йонна сила 0,15 M.

Референтните стойности за албумина са $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL и $T_m = 63°C$. Фосфатният буфер има диелектрична константа 76,0.

1. Член за pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Съотношение: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Йонен член: йонната сила (0,15 M) е равна на референтната стойност, така че съотношението е 1.
3. Температурен член: температурата (25 °C) е равна на референтната стойност, така че съотношението е 1.
4. Член за разтворителя: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Калкулаторът отчита 492,12 mg/mL, което попада в категорията „силно разтворим“.

Пример: лизозим в глицерол при ниска температура

Да се намери разтворимостта на лизозима в разтвор на глицерол при 4 °C, pH 5,0 и йонна сила 0,1 M. Това са условия, подобни на тези при съхранение на ензим на студено.

Референтните стойности за лизозима са $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL и $T_m = 72°C$. Глицеролът има диелектрична константа 42,5.

1. Член за pH: промяната от pH 7,0 към pH 5,0 (и двете доста под pI 11,35) променя члена за pH само леко. Съотношение: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Йонен член: понижаването на йонната сила от 0,15 M до 0,1 M леко повишава разтворимостта чрез ефекта на осоляване навътре. Съотношение: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Температурен член: охлаждането от 25 °C до 4 °C, доста под точката на топене, понижава стойността на члена. Съотношение: 0,8106 щ.д.$.
4. Член за разтворителя: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Калкулаторът отчита 35,88 mg/mL, което попада в категорията „разтворим“. Ниската диелектрична константа на глицерола, а не ниската температура, е причината резултатът да е по-нисък от референтната стойност.

Как се използва калкулаторът за разтворимост на протеини

1. Изберете протеин от списъка: албумин, инсулин, лизозим, хемоглобин, миоглобин, колаген, казеин или фибриноген.
2. Изберете разтворител: вода, фосфатен буфер, Трисов буфер, глицерол, ДМСО, метанол, етанол или ацетон.
3. Въведете температурата в °C (0 до 100), pH (0 до 14) и йонната сила в молове на литър (0 до 2).
4. Прочетете изчислената разтворимост в mg/mL и нейната категория. Лента под резултата показва стойността по скала от 0 до 100 mg/mL и се запълва напълно при 100 mg/mL или повече.

Какво влияе върху разтворимостта на протеините

pH и изоелектрична точка. Всеки протеин има изоелектрична точка — pH, при което повърхността му няма нетен електричен заряд. При това pH молекулите на протеина не се отблъскват и затова се слепват и по-лесно изпадат от разтвора. Преместването на pH в която и да е посока спрямо изоелектричната точка придава на протеина нетен заряд. Заредените молекули се отблъскват, което ги държи разделени и разтворени.

Йонна сила. Разтворените солни йони обграждат заредените групи по повърхността на протеина. При ниски до умерени концентрации тези йони екранират зарядите, които иначе биха привлекли две протеинови молекули една към друга, и така повишават разтворимостта. Това се нарича осоляване навътре. При високи концентрации на сол йоните се конкурират с протеина за водните молекули и отнемат водния слой, който поддържа протеина разтворен. Това се нарича осоляване навън и е в основата на разпространен метод за пречистване, при който амониев сулфат се използва за утаяване на протеини от смес.

Температура. Затоплянето на разтвора обикновено повишава разтворимостта до определен момент. Когато температурата се приближи до точката на топене на протеина, той започва да се разгъва. Разгъването излага хидрофобни (отблъскващи водата) участъци на протеина, които обикновено са скрити във вътрешността на нагънатата му структура. Тези изложени участъци се слепват един с друг и причиняват агрегация, така че разтворимостта рязко спада при и над точката на топене.

Разтворител. Диелектричната константа на разтворителя измерва доколко ефективно той отслабва електричното привличане между заредени частици. Водата има висока диелектрична константа и разделя зарядите добре, поради което повечето протеини се разтварят по-добре във вода, отколкото в органични разтворители като етанол или ацетон. Разтворителите с ниска диелектрична константа позволяват на противоположните заряди върху различни протеинови молекули да се привличат по-силно, което насърчава агрегацията.

Ограничения

Калкулаторът използва опростен модел, изграден върху малък набор от референтни протеини и стандартни разтворители. Той не отчита чистотата на протеина, добавки като детергенти или стабилизатори, нито необичайни компоненти на буфера. Резултатите са оценки за планиране на експерименти, а не заместител на прякото измерване на разтворимостта в лаборатория.

Често задавани въпроси

Какво представлява разтворимостта на протеините? Разтворимостта на протеините е максималната концентрация на протеин, която остава напълно разтворена в разтворител, без да образува видими агрегати или утайка.

Защо протеинът е най-слабо разтворим при изоелектричната си точка? При изоелектричната точка протеинът няма нетен електричен заряд, така че протеиновите молекули вече не се отблъскват електрически. Без това отблъскване те по-лесно се слепват и изпадат от разтвора.

Каква е разликата между осоляване навътре и осоляване навън? Осоляването навътре се наблюдава при ниски концентрации на сол, когато разтворените йони екранират заредените групи на протеина една от друга и повишават разтворимостта. Осоляването навън се наблюдава при високи концентрации на сол, когато йоните отнемат водата от повърхността на протеина и понижават разтворимостта.

По-високата температура винаги ли повишава разтворимостта? Не. Разтворимостта обикновено нараства с температурата само до определен момент. Когато температурата се приближи до точката на топене на протеина, той започва да се разгъва, което обикновено причинява агрегация и рязък спад на разтворимостта.

Защо протеините се разтварят по-слабо в етанол или ацетон, отколкото във вода? Водата има висока диелектрична константа, което означава, че много ефективно отслабва електричното привличане между заредените части на протеиновите молекули. Етанолът и ацетонът имат по-ниски диелектрични константи, така че заредените групи върху различни протеинови молекули се привличат по-силно в тези разтворители и агрегацията става по-вероятна.

Колко точен е този калкулатор? Той дава оценка въз основа на физичен модел и малък набор от референтни протеини и разтворители. Полезен е за стесняване на условията, които да бъдат изследвани, но експерименталното измерване остава единственият начин да се потвърди разтворимостта на конкретна протеинова проба.

Допълнителна литература

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Механизъм на осоляването навътре и навън на протеини чрез соли на двувалентни катиони. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Измерване и повишаване на разтворимостта на протеини. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Белтъци, аминокиселини и пептиди като йони и диполярни йони. Издателство Reinhold.