BCA калкулатор за обемни проби | Инструмент за количествено определяне на протеини

Какво представлява калкулаторът за обем на проба за BCA

Калкулаторът за обем на проба за BCA преобразува измерената абсорбция при BCA анализа на протеини в обема на пробата, в микролитри (μL), необходим за внасяне на целево количество протеин. Той се използва след извършване на анализ на протини с бицинхонинова киселина (BCA) — широко разпространен лабораторен тест, който измерва количеството протеин в разтвор чрез определяне на интензитета на лилавото светлопоглъщащо оцветяване, развило се в пробата.

Как BCA анализът измерва протеина

BCA анализът протича на два етапа. Първо, протеинът в пробата редуцира медните йони (Cu²⁺) до друга форма (Cu¹⁺) в алкален разтвор. Степента на редукция зависи от количеството наличен протеин. Второ, бицинхониновата киселина се свързва с редуцираната мед и образува лилаво съединение, което силно поглъща светлина при дължина на вълната 562 нанометра (nm).

Спектрофотометър измерва колко светлина поглъща пробата при 562 nm. Тази стойност се нарича абсорбция. По-тъмният лилав цвят означава по-висока абсорбция и повече протеин. В лабораторията абсорбцията на всяка проба се сравнява със стандартна крива, изградена чрез измерване на известни концентрации на референтен протеин, обикновено говежди серумен албумин (BSA).

BCA е популярен, защото продължава да работи, когато пробата съдържа детергенти като SDS или Triton X-100 — химикали, често срещани в буферите за клетъчен лизис, които обаче нарушават два по-стари анализа: методите на Брадфорд и Лоури.

Формула за преобразуване на BCA абсорбция в обем на пробата

Стандартната BCA крива е права линия, апроксимирана спрямо абсорбцията и концентрацията:

$\text{Абсорбция} = \text{Наклон} \times \text{Концентрация} + \text{Отсечка}$

За обратното преобразуване — от измерената абсорбция обратно към концентрацията на протеина — уравнението се преобразува:

$\text{Концентрация на протеина (μg/μL)} = \frac{\text{Абсорбция} - \text{Отсечка}}{\text{Наклон}}$

След като концентрацията е известна, обемът на пробата, който съдържа целева маса протеин, е:

$\text{Обем на пробата (μL)} = \frac{\text{Маса на пробата (μg)}}{\text{Концентрация на протеина (μg/μL)}}$

Калкулаторът предлага четири предварително зададени типа криви, всеки със свой наклон и свободен член. Отсечката е 0 при всяка предварително зададена крива, тъй като измерванията са коригирани спрямо празната проба (абсорбцията на контролата без протеин първо се изважда). Наклонът показва каква част от диапазона на абсорбция на плаката обхваща работният диапазон на съответния протокол.

По-чувствителният протокол, предназначен за разредени проби, дава по-голяма абсорбция на микрограм протеин и затова има по-голям наклон. Подобреният BCA и микро BCA са предназначени за проби, които са твърде разредени, за да бъдат измерени точно със стандартния протокол.

Как се изчислява обемът на пробата от BCA абсорбцията

1. Извършете BCA анализа и измерете абсорбцията при 562 nm за всяка проба.
2. Изберете типа крива, който съответства на използвания протокол (стандартен, подобрен или микро), или въведете собствен наклон и отсечка от крива, генерирана същия ден.
3. Въведете измерената абсорбция и целевата маса на протеина, в микрограми, за всяка проба.
4. Калкулаторът преобразува абсорбцията в концентрация на протеина, след което разделя целевата маса на тази концентрация, за да получи обема за пипетиране.

Пример: Изчисляване на обем на проба от BCA абсорбцията

Изследовател, който подготвя уестърн блот, се нуждае от 20 мкг протеин на лента и използва стандартната BCA крива (наклон 1,0, отсечка 0).

Проба A има абсорбция 0,75:

• Концентрация на протеина = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 мкг/μL
• Обем на пробата = 20 мкг ÷ 0,75 мкг/μL = 26,67 мкл

Проба B има абсорбция 1,2:

• Концентрация на протеина = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 мкг/μL
• Обем на пробата = 20 мкг ÷ 1,2 мкг/μL = 16,67 мкл

Проба A е по-разредена, затова е необходим по-голям обем, за да се достигне същата целева стойност от 20 мкг.

Как да се разбират резултатите от калкулатора

Калкулаторът отчита две стойности за всяка проба: концентрация на протеина в μg/μL и обем на пробата в μL. Той също маркира резултати, които вероятно ще създадат проблеми:

• Абсорбция над 3,0 задейства предупреждение, тъй като типичните BCA измервания са между 0 и 2,0.
• Абсорбция под 0,05, но над нулата, задейства предупреждение, че резултатът може да е по-неточен, тъй като слабият сигнал е по-чувствителен към измервателния шум.
• Изчислен обем от 1000 мкл или повече задейства предупреждение да се използва по-концентрирана проба.
• Изчислен обем под 0,5 мкл задейства предупреждение, че обемът може да е труден за точно пипетиране.
• Отрицателната абсорбция или отрицателната маса на пробата се отхвърлят директно.

Практически лабораторни приложения

Поддържането на еднакво количество протеин при зареждането е една от най-честите причини за неуспех при уестърн блот: неравномерният интензитет на ивиците в различните писти често се дължи на различно заредено количество протеин, а не на действителни разлики в експресията. Изчисляването на точен обем за всяка проба въз основа на собственото ѝ измерване на абсорбцията осигурява равномерно зареждане в целия гел.

Същото изчисление се прилага при ензимни анализи, при които сравняването на активността между условията изисква еднакво начално общо количество протеин, както и при имунопреципитация, където неравномерното входно количество протеин (например 800 мкг в една епруветка спрямо 1200 мкг в друга) затруднява сравняването на резултатите. При пречистване на протеини същата формула се използва на всяка стъпка, за да се проследи колко протеин се запазва във всяка фракция.

Сравнение с други анализи на протеини

Кратка история на количественото определяне на протеини

Ранните измервания на протеини се основават на метода на Келдал (1883), който измерва съдържанието на азот след разграждане на пробата в киселина. Тестът на Биурет, разработен в началото на 1900-те години, използва цветна реакция между пептидните връзки и медните йони, но не е особено чувствителен. Оливър Лоури комбинира реакцията на Биурет с допълнителен реагент през 1951 г., създавайки метода на Лоури, който доминира при измерването на протеини в продължение на десетилетия, въпреки че се нарушава от обичайни лабораторни химикали като детергенти и EDTA. Марион Брадфорд въвежда по-бърз метод, основан на свързване на багрило, през 1976 г., но и той не работи в присъствието на детергенти и дава различни резултати в зависимост от аминокиселинния състав на протеина. Пол Смит и колегите му от Pierce Chemical Company публикуват метода BCA през 1985 г., като комбинират химията на Биурет с по-голямата чувствителност на бицинхониновата киселина към медта и създават анализ, устойчив на детергентите, съдържащи се в типичните клетъчни лизати.

Пример с код

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Често задавани въпроси

За какво се използва BCA анализът? Той измерва общата концентрация на протеина в разтвор, най-често преди внасяне на еднакви количества протеин при уестърн блот, преди нормализиране на ензимни анализи за активност или при проследяване на добива по време на пречистване на протеини.

Колко точен е BCA анализът? При добри условия резултатите обикновено са точни в границите на 5–10%, ако стандартната крива има поне пет или шест точки и пробата не съдържа висока концентрация на интерфериращо вещество.

Какво влияе на резултатите от BCA анализа? Редуциращите агенти, включително DTT и β-меркаптоетанол, изкуствено повишават абсорбцията, тъй като сами редуцират медта, независимо от протеина. Хелатиращи агенти като EDTA понижават абсорбцията, като свързват медта, преди тя да може да реагира.

Каква е разликата между BCA и анализа на Брадфорд? Методът на Брадфорд дава резултат за около пет минути, но се нарушава от детергенти и реагира по различен начин в зависимост от аминокиселинния състав на протеина. BCA отнема около 30 минути, но е устойчив на детергенти и дава по-постоянни измервания при различни протеини, което го прави по-добрият избор за клетъчни лизати.

Защо изчисленият обем на пробата е необичайно голям? Големият обем означава, че измерената концентрация на протеина е по-ниска от очакваното. Честите причини включват непълен клетъчен лизис, прекомерно разредена проба или измерване на абсорбция близо до долната граница на откриване на анализа. Концентрирането на пробата с центробежен филтър или преминаването към подобрен или микро BCA протокол обикновено решава проблема.

Какво трябва да се направи, ако абсорбцията е извън линейния диапазон? Разредете пробата и измерете отново. Връзката между абсорбцията и концентрацията се нарушава над приблизително 2,0, така че екстраполацията извън стандартната крива подценява действителната концентрация.

Източници

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT и др. „Measurement of protein using bicinchoninic acid.“ Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85.
2. Thermo Fisher Scientific. „Pierce BCA Protein Assay Kit“, ръководство за потребителя (MAN0011430).
3. Bradford MM. „A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein.“ Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.