Изчислете прецизни обеми на проби на базата на стойности на абсорбция от BCA теста и желаната маса на протеина. Съществено за последователно натоварване на протеини в западни блотове и други лабораторни приложения.
Този инструмент изчислява необходимия обем на пробата въз основа на резултатите от абсорбцията на BCA и масата на пробата. Въведете стойността на абсорбцията и масата на пробата за всяка проба, за да изчислите съответния обем на пробата.
Обемът на пробата се изчислява с помощта на следната формула:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Калькулаторът на обема на пробата за абсорбция на BCA е специализиран инструмент, проектиран да помогне на изследователи и лабораторни техници точно да определят подходящия обем на пробата за експерименти, базирани на резултатите от BCA (бицинхонинова киселина) теста. Този калькулатор взема предвид показанията на абсорбцията от вашия BCA тест и желаната маса на пробата, за да изчисли точния обем, необходим за последователно натоварване на протеини в приложения като уестърн блотинг, ензимни тестове и други техники за анализ на протеини.
BCA тестът е един от най-широко използваните методи за количествено определяне на протеини в лабораториите по биохимия и молекулярна биология. Чрез измерване на абсорбцията на вашите протеинови проби и сравняването им с стандартна крива, можете да определите концентрацията на протеини с висока точност. Нашият калькулатор опростява този процес, като автоматично преобразува показанията на абсорбцията в точните обеми на пробите, необходими за вашите експерименти.
Bicinchoninic Acid (BCA) тестът е биохимичен тест за определяне на общата концентрация на протеин в разтвор. Принципът на този тест се основава на образуването на комплекс Cu²⁺-протеин при алкални условия, последвано от редукция на Cu²⁺ до Cu¹⁺. Количеството на редукцията е пропорционално на наличния протеин. BCA образува пурпурен комплекс с Cu¹⁺ в алкална среда, предоставяйки основа за наблюдение на редукцията на медта от протеините.
Интензивността на пурпурния цвят нараства пропорционално с концентрацията на протеин, което може да бъде измерено с помощта на спектрофотометър на приблизително 562 nm. Показанията на абсорбцията след това се сравняват със стандартна крива, за да се определи концентрацията на протеин в неизвестни проби.
Основната формула за изчисляване на обема на пробата от резултатите от абсорбцията на BCA е:
Където:
Концентрацията на протеин се изчислява от показанието на абсорбцията, използвайки уравнението на стандартната крива:
За стандартен BCA тест, типичният наклон е приблизително 2.0, а пресечната точка често е близка до нула, въпреки че тези стойности могат да варират в зависимост от специфичните условия на теста и стандартната крива.
Нашият калькулатор опростява процеса на определяне на обемите на пробите от резултатите от BCA теста. Следвайте тези стъпки, за да получите точни изчисления:
Въведете информация за пробата:
Изберете тип на стандартната крива:
Прегледайте резултатите:
Копирайте или експортирайте резултатите:
Нека преминем през практичен пример:
Това означава, че трябва да натоварите 13.33 μL от вашата проба, за да получите 20 μg протеин.
Калькулаторът предоставя няколко важни парчета информация:
Концентрация на протеин: Тази стойност се изчислява от показанието на абсорбцията, използвайки избраната стандартна крива. Тя представлява количеството протеин на единица обем в пробата ви (μg/μL).
Обем на пробата: Това е обемът на вашата проба, който съдържа желаното количество протеин. Тази стойност е това, което ще използвате при подготовката на вашите експерименти.
Предупреждения и препоръки: Калькулаторът може да предостави предупреждения за:
Едно от най-често срещаните приложения за този калькулатор е подготовката на проби за уестърн блотинг. Последователното натоварване на протеини е от решаващо значение за надеждни резултати от уестърн блот, а този калькулатор осигурява, че натоварвате едно и също количество протеин за всяка проба, дори когато техните концентрации се различават.
Примерен работен процес:
За ензимни тестове често е необходимо да се използва специфично количество протеин, за да се стандартизират условията на реакцията между различни проби или експерименти.
Примерен работен процес:
В експериментите с имунопреципитация, започването с последователно количество протеин е важно за сравняване на резултатите между различни условия.
Примерен работен процес:
По време на пречистването на протеини, често е необходимо да се проследи концентрацията на протеин и да се изчислят добивите на различни стъпки.
Примерен работен процес:
Докато калькулаторът предоставя стандартни параметри за стандартните BCA тестове, можете също да въведете персонализирани стойности, ако сте генерирали собствена стандартна крива. Това е особено полезно, когато:
За да използвате персонализирана стандартна крива:
Калькулаторът позволява да добавите множество проби и да изчислите техните обеми едновременно. Това е особено полезно, когато подготвяте проби за експерименти, които изискват последователно натоварване на протеини между множество условия.
Ползи от обработката на партиди:
Ако вашето показание на абсорбцията е над 2.0, то може да бъде извън линейния обхват на BCA теста. В такива случаи:
За показания на абсорбцията под 0.1, можете да бъдете близо до границата на откритие на теста, което може да повлияе на точността. Обмислете:
Ако калькулаторът предлага обем, който е твърде голям за вашето приложение:
Точното количествено определяне на протеини е основно изискване в биохимията и молекулярната биология откакто тези области се появиха. Ранните методи разчитаха на определяне на съдържанието на азот, което беше времеемко и изискваше специализирано оборудване.
Метод на Kjeldahl (1883): Един от най-ранните методи за количествено определяне на протеини, основан на измерване на съдържанието на азот.
Тест на Biuret (началото на 1900-те): Този метод разчита на реакцията между пептидните връзки и медните йони в алкална разтвор, произвеждайки виолетов цвят.
Тест на Lowry (1951): Разработен от Оливър Лоури, този метод комбинира реакцията на Biuret с реагента Folin-Ciocalteu, увеличавайки чувствителността.
Тест на Bradford (1976): Марион Брадфорд разработи този метод, използвайки багрилото Coomassie Brilliant Blue G-250, което се свързва с протеините и променя максимума на абсорбцията.
BCA тест (1985): Разработен от Пол Смит и колегите му в Pierce Chemical Company, този метод комбинира реакцията на Biuret с откритие на BCA, предлагайки подобрена чувствителност и съвместимост с детергенти.
BCA тестът за първи път е описан в статия от 1985 г. на Смит и др. с заглавие "Измерване на протеин с помощта на бицинхонинова киселина." Той е разработен, за да адресира ограниченията на съществуващите методи, особено влиянието на различни химикали, често използвани в извличането и пречистването на протеини.
Ключовата иновация беше използването на бицинхонинова киселина за откритие на Cu¹⁺ йони, произведени от редукцията на Cu²⁺ от протеините, образувайки пурпурен комплекс, който може да бъде измерен спектрофотометърно. Това предостави няколко предимства:
От своето въвеждане, BCA тестът стана един от най-широко използваните методи за количествено определяне на протеини в лабораториите по биохимия и молекулярна биология по целия свят.
1=IF(B2<=0,"Грешка: Невалидна абсорбция",IF(C2<=0,"Грешка: Невалидна маса на пробата",C2/(2*B2)))
2
3' Където:
4' B2 съдържа показанието на абсорбцията
5' C2 съдържа желаната маса на пробата в μg
6' Формулата връща необходимия обем на пробата в μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Изчислете концентрацията на протеин от абсорбцията, използвайки стандартната крива."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Абсорбцията не може да бъде отрицателна")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Изчислете необходимия обем на пробата на базата на абсорбцията и желаната маса."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Масата на пробата трябва да бъде положителна")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Изчислената концентрация на протеин трябва да бъде положителна")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Пример за използване
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"За абсорбция {absorbance} и желана маса на протеин {sample_mass} μg:")
31 print(f"Концентрация на протеин: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Необходим обем на пробата: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Грешка: {e}")
351# Функция за изчисляване на концентрацията на протеин от абсорбция
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Абсорбцията не може да бъде отрицателна")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Функция за изчисляване на обема на пробата
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Масата на пробата трябва да бъде положителна")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Изчислената концентрация на протеин трябва да бъде положителна")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Пример за използване
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("За абсорбция %.2f и желана маса на протеин %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Концентрация на протеин: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Необходим обем на пробата: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Грешка: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Абсорбцията не може да бъде отрицателна");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Масата на пробата трябва да бъде положителна");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Изчислената концентрация на протеин трябва да бъде положителна");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Пример за използване
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`За абсорбция ${absorbance} и желана маса на протеин ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Концентрация на протеин: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Необходим обем на пробата: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Грешка: ${error.message}`);
37}
38Връзката между абсорбцията и концентрацията на протеин обикновено е линейна в определен диапазон. По-долу е визуализация на стандартната крива на BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Различните методи за количествено определяне на протеини имат различни предимства и ограничения. Ето как BCA тестът се сравнява с други общи методи:
| Метод | Диапазон на чувствителност | Предимства | Ограничения | Най-добър за |
|---|---|---|---|---|
| BCA тест | 5-2000 μg/mL | • Съвместим с детергенти • По-малко вариация между протеини • Стабилно развитие на цвета | • Влияе от редуциращи агенти • Податлив на някои хелатиращи агенти | • Общо количествено определяне на протеини • Проби, съдържащи детергенти |
| Тест на Bradford | 1-1500 μg/mL | • Бърз (2-5 мин) • Малко вещества, които влияят | • Висока вариация между протеини • Несъвместим с детергенти | • Бързи измервания • Проби без детергенти |
| Метод на Lowry | 1-1500 μg/mL | • Добре установен • Добра чувствителност | • Много вещества, които влияят • Множество стъпки | • Историческа последователност • Чисти протеинови проби |
| UV абсорбция (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Ненасилствен • Много бърз • Няма нужда от реагенти | • Влияе от нуклеинови киселини • Изисква чисти проби | • Чисти протеинови разтвори • Бързи проверки по време на пречистване |
| Флуорометричен | 0.1-500 μg/mL | • Най-висока чувствителност • Широк динамичен диапазон | • Скъпи реагенти • Изисква флуорометр | • Много разредени проби • Ограничен обем на пробата |
BCA (бицинхонинова киселина) тестът се използва основно за количествено определяне на общата концентрация на протеин в проба. Той е широко използван в биохимията, клетъчната биология и молекулярната биология за приложения като уестърн блотинг, ензимни тестове, имунопреципитация и пречистване на протеини.
BCA тестът обикновено е точен в рамките на 5-10%, когато се извършва правилно. Неговата точност зависи от няколко фактора, включително качеството на стандартната крива, отсъствието на вещества, които влияят, и дали съставът на неизвестния протеин е подобен на стандарта, използван.
Няколко вещества могат да повлияят на резултатите от BCA теста, включително:
Основните разлики са:
Ако калькулаторът показва много голям обем на пробата, обикновено това показва ниска концентрация на протеин в пробата. Това може да бъде поради:
Обмислете концентрирането на пробата си или регулиране на експерименталния си дизайн, за да вземете предвид по-ниската концентрация на протеин.
Този калькулатор е специално проектиран за резултати от BCA тест. Докато основният принцип (преобразуване на концентрация в обем) важи за други методи, връзката между абсорбцията и концентрацията на протеин варира между различни тестове. За други методи като Bradford или Lowry, ще трябва да използвате различни параметри на стандартната крива.
За показания на абсорбцията извън линейния обхват (обикновено >2.0):
Бовинският серумен албумин (BSA) е най-често използваният стандарт за BCA тестове, защото е:
Въпреки това, ако вашите проби съдържат преобладаващ протеин, който значително се различава от BSA, обмислете използването на този протеин като ваш стандарт за по-точни резултати.
Пурпурният цвят, разработен в реакцията на BCA, е стабилен за няколко часа при стайна температура и може да бъде измерен по всяко време в този период. Въпреки това, за най-добри резултати, се препоръчва да измерите всички стандарти и проби приблизително по същото време след развитието на цвета.
Докато е технически възможно да се повтори стандартна крива, не се препоръчва за точни количествени резултати. Вариации в реагентите, условията на инкубация и калибрирането на инструмента могат да повлияят на връзката между абсорбцията и концентрацията на протеин. За надеждни резултати, генерирайте свежа стандартна крива всеки път, когато извършвате теста.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Измерване на протеин с помощта на бицинхонинова киселина." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Инструкции. Достъпно на: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "Тестът на бицинхониновата киселина (BCA) за количествено определяне на протеин." В: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Тестове за определяне на концентрацията на протеин." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Количествено определяне на протеин." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Сега, когато разбирате принципите зад количественото определяне на протеини с BCA и изчисляването на обема на пробата, опитайте нашия калькулатор, за да опростите работния процес в лабораторията си. Просто въведете показанията на абсорбцията и желаната маса на пробата, за да получите незабавни, точни изчисления на обема на пробата.
Независимо дали подготвяте проби за уестърн блотинг, ензимни тестове или всякакви други експерименти, базирани на протеини, нашият калькулатор ще помогне да се осигурят последователни и надеждни резултати. Спестете време, намалете грешките и подобрете възпроизводимостта на експериментите си с калькулатора на обема на пробата за абсорбция на BCA.
Открийте още инструменти, които може да бъдат полезни за вашия работен процес