Enzymaktivitetsberegner - Michaelis-Menten Kinetik

Beregner for enzymaktivitet

En beregner for enzymaktivitet finder, hvor hurtigt et enzym omdanner substrat til produkt, udtrykt som specifik aktivitet i enheder pr. milligram (U/mg). Den bruger Michaelis-Menten-ligningen, standardmodellen for enzymkinetik, sammen med mængden af enzymprotein i prøven.

Enzymer er proteiner, der øger hastigheden af kemiske reaktioner i celler uden selv at blive opbrugt. Forskere måler, hvor aktivt et enzym er, for at sammenligne forskellige batcher, kontrollere om et oprensningstrin virkede, eller undersøge, hvordan et lægemiddel påvirker enzymets hastighed. Et tal for enzymkoncentrationen alene siger ikke, om enzymet udfører sin funktion. Det gør den specifikke aktivitet.

Hvad beregneren beregner

Værktøjet bruger fem input: enzymkoncentration, substratkoncentration, Michaelis-konstanten (Km), maksimumshastigheden (Vmax) og reaktionstiden. Reaktionstiden registreres som reference, men indgår ikke i formlen. Vmax er allerede en hastighed, altså en mængde substrat omdannet pr. minut, så tiden er indbygget i den. Hvis man dividerer med tiden igen, tælles den to gange.

Beregneren returnerer ét tal og ét diagram:

• Specifik aktivitet, i U/mg. Det er reaktionshastigheden divideret med mængden af tilstedeværende enzymprotein.
• Et diagram over reaktionshastigheden som funktion af substratkoncentrationen, der viser kurvens lave, overgangs- og mætningsområder. Hastigheden ved den indtastede substratkoncentration er markeret på diagrammet.

Sådan beregnes enzymaktivitet

Michaelis-Menten-ligningen

Leonor Michaelis og Maud Menten publicerede denne model i 1913. Den beskriver, hvordan et enzyms reaktionshastighed afhænger af substratkoncentrationen:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = reaktionshastighed, hastigheden ved en given substratkoncentration
• $V_{max}$ = maksimumshastighed, hastigheden når enzymet er fuldstændig mættet med substrat
• $[S]$ = substratkoncentration
• $K_m$ = Michaelis-konstanten: den substratkoncentration, hvor hastigheden er halvdelen af Vmax

Formel for specifik aktivitet

Den specifikke aktivitet dividerer denne hastighed med mængden af tilstedeværende enzymprotein og giver et resultat i enheder pr. milligram (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Her er $A$ den specifikke aktivitet og $[E]$ enzymkoncentrationen.

Én enzymenhed (U) er den mængde enzym, der omdanner 1 mikromol (µmol) substrat pr. minut. Denne definition er fastlagt af International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB).

Enhederne hænger sammen på følgende måde. I Michaelis-Menten-ligningen har hastigheden enheden substratkoncentration divideret med tid. Beregneren bruger [S] og Km i mM, så Vmax og v er angivet i µmol pr. minut pr. milliliter, skrevet µmol/(min·mL). Det er det samme som mM/min og det samme som U/mL. Enzymkoncentrationen [E] er i mg/mL. Ved division forkortes milliliterne:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax indeholder allerede «pr. minut», så der skal ikke indgå et separat tidsled i formlen.

Beregningen forudsætter, at den målte hastighed er en initialhastighed, målt tidligt i reaktionen, før substratet bliver begrænset, eller produktet begynder at hæmme enzymet. I laboratorier måler man typisk de første 5–10% af substratomdannelsen for at holde sig i dette lineære område.

Regneeksempel

Eksempel 1. Enzymkoncentration 1 mg/mL, substratkoncentration 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Det er de værdier, beregneren starter med.

Hastighed = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Specifik aktivitet = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Eksempel 2. Samme betingelser, men enzymkoncentrationen er fordoblet til 2 mg/mL.

Hastighed = 33,33 µmol/(min·mL), uændret, da hastigheden ikke afhænger af [E] i denne ligning. Specifik aktivitet = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

En fordobling af enzymmængden halverer den specifikke aktivitet, fordi den samme samlede hastighed nu fordeles på dobbelt så meget protein.

Eksempel 3. Substratkoncentrationen hæves til 100 mM, langt over Km, med en enzymkoncentration på 1 mg/mL, Km 5 mM og Vmax 50 µmol/(min·mL).

Hastighed = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Specifik aktivitet = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Ved høj substratkoncentration er enzymet næsten mættet, så hastigheden ligger tæt på Vmax.

Eksempel 4. Substratkoncentrationen sænkes til 1 mM, under Km, med en enzymkoncentration på 1 mg/mL, Km 5 mM og Vmax 50 µmol/(min·mL).

Hastighed = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Specifik aktivitet = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Under Km begrænser små mængder substrat reaktionen, så både hastigheden og den specifikke aktivitet ligger langt under Vmax.

Forklaring af de vigtigste parametre

Enzymkoncentration [E] er massen af enzymprotein pr. volumen, angivet i mg/mL. En højere værdi fordeler den samme reaktionshastighed på mere protein, hvilket sænker den specifikke aktivitet. Det er den specifikke aktivitet, ikke den rå koncentration, der viser, om et enzympræparat fungerer godt.

Substratkoncentration [S] er den mængde substrat, enzymet har til rådighed, normalt angivet i mM. Ved lav [S] giver små stigninger en kraftig øgning af hastigheden. Nær mætning hjælper ekstra substrat kun lidt.

Michaelis-konstanten (Km) er den substratkoncentration, hvor hastigheden er lig med halvdelen af Vmax. En lav Km betyder, at enzymet når halv hastighed ved en lav substratkoncentration, hvilket tyder på stærk binding mellem enzym og substrat. Hexokinase har for eksempel en Km nær 0,1 mM for glukose, hvilket viser høj affinitet.

Maksimumshastigheden (Vmax) er hastigheden, når substratet ikke længere er begrænsende. Angiv den i µmol/(min·mL), det samme som mM/min eller U/mL, så den stemmer overens med mM-enhederne for [S] og Km. Den afhænger af, hvor meget enzym der er til stede, og hvor hurtigt hvert enzymmolekyle kan omsætte substrat (dets omsætningstal, kcat).

Reaktionstid er, hvor længe analysen varede. Den er nyttig ved planlægning af et forsøg, fordi en reaktion, der får lov at køre for længe, kan udtømme substratet og ophøre med at opføre sig lineært. Den indgår ikke i selve formlen for specifik aktivitet.

Sådan aflæses hastighedskurven

Diagrammet viser hastigheden som funktion af substratkoncentrationen ved hjælp af Michaelis-Menten-ligningen.

• Under Km: Hastigheden stiger omtrent proportionalt med substratet. Små fejl i substratkoncentrationen giver store fejl i resultatet.
• Nær Km: Kurven bøjer. Hastigheden er halvdelen af Vmax.
• Over Km: Kurven flader ud. Ekstra substrat giver kun en lille ekstra hastighed, fordi enzymet næsten er mættet.

Hvorfor den specifikke aktivitet er vigtig

Specifik aktivitet er et standardmål for enzymers renhed og kvalitet. Under oprensning følger forskerne den ved hvert trin: Et råt celleekstrakt kan vise nogle få U/mg, mens en stærkt oprenset prøve kan nå hundreder eller tusinder af U/mg. En stigende specifik aktivitet gennem en oprensningsproces viser, at inaktivt protein fjernes, mens det ønskede enzym bevares.

Den samme måling bruges i lægemiddeludvikling, hvor forskere undersøger, hvordan kandidatstoffer sænker et enzyms aktivitet, og i klinisk diagnostik, hvor læger måler enzymer som ALT og AST i blodet for at undersøge leverskade.

Ofte stillede spørgsmål

Hvordan beregner man enzymaktivitet ud fra Km og Vmax? Find først reaktionshastigheden med Michaelis-Menten-ligningen, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Divider derefter med enzymkoncentrationen for at få den specifikke aktivitet i U/mg: Aktivitet = v / [E]. Brug Vmax i µmol/(min·mL) og [E] i mg/mL, så enhederne forkortes til U/mg.

Hvad er en enhed (U) for enzymaktivitet? Én enhed er den mængde enzym, der under de angivne betingelser omdanner 1 µmol substrat pr. minut, som defineret af IUBMB.

Hvorfor indeholder formlen ikke reaktionstid? Vmax er allerede udtrykt som en mængde pr. minut og er derfor en hastighed, ikke en samlet mængde. Hvis man dividerer med tiden igen, tælles den to gange, og resultatet kommer til at afhænge af, hvor længe analysen varede. Det bør ikke ske for en egenskab ved selve enzymet.

Hvorfor falder den specifikke aktivitet, når enzymkoncentrationen stiger? Hastigheden i Michaelis-Menten-ligningen afhænger ikke af enzymkoncentrationen. Den specifikke aktivitet dividerer denne faste hastighed med [E], så en større [E] giver et mindre resultat. Enzympræparater med forskellige koncentrationer sammenlignes retfærdigt ved at sammenligne den specifikke aktivitet, ikke den rå hastighed.

Hvad betyder en lav Km? En lav Km betyder, at enzymet når halvdelen af sin maksimumshastighed ved en lav substratkoncentration, hvilket viser, at enzym og substrat binder stærkt til hinanden.

Kan specifik aktivitet være negativ? Nej. Et negativt resultat peger på en inputfejl, for eksempel en negativ koncentration, eller en beregningsfejl, ikke på en reel enzymmåling.

Referencer

1. Michaelis, L., & Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2012). Biochemistry (7. udg.). W.H. Freeman and Company.
3. International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Enzyme Nomenclature. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. BRENDA Enzyme Database. https://www.brenda-enzymes.org/