Protein Opløselighedsberegner - Gratis pH & Temperatur Værktøj

En beregner for proteinopløselighed estimerer den højeste koncentration af et protein, der forbliver opløst i et opløsningsmiddel ved en given pH-værdi, temperatur og ionstyrke. Den omsætter grundlæggende kemi til ét tal, angivet i milligram protein pr. milliliter opløsningsmiddel.

Proteinopløselighed er vigtig inden for biokemi, lægemiddelformulering og fødevarevidenskab. Et protein, der ikke forbliver opløst, danner aggregater eller udfældes, hvilket kan ødelægge et eksperiment eller gøre et lægemiddel umuligt at injicere.

Sådan beregnes proteinopløselighed

Opløseligheden afhænger af fem ting: proteinets isoelektriske punkt (den pH-værdi, hvor dets nettoladning er nul), dets smeltepunkt (den temperatur, hvor det begynder at udfolde sig), opløsningsmidlets dielektricitetskonstant (et mål for, hvor godt det adskiller ladede partikler), opløsningens pH-værdi og ionstyrken (et mål for, hvor meget opløst salt der er til stede).

Beregneren tager udgangspunkt i hvert proteins kendte opløselighed i vand under et sæt referencebetingelser: 25 °C, pH 7,0 og en ionstyrke på 0,15 M (omtrent saltniveauet i blod). Derefter multiplicerer den denne referenceværdi med fire forholdstal, ét for hver betingelse, der er ændret.

Formel for proteinopløselighed

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ er proteinets kendte opløselighed i vand under referencebetingelserne, angivet i mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, hvor $pI$ er proteinets isoelektriske punkt. Opløseligheden er lavest ved det isoelektriske punkt og stiger, når pH-værdien bevæger sig væk fra det, hvorefter den flader ud inden for et par pH-enheder.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, hvor $I$ er ionstyrken i mol pr. liter. Ved lave saltniveauer øger dette led opløseligheden en smule ("salting in"). Ved høje saltniveauer sænker det opløseligheden ("salting out").
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, hvor $T_m$ er proteinets smeltepunkt i °C. Opløseligheden stiger langsomt med temperaturen og falder derefter kraftigt, når temperaturen nærmer sig $T_m$, og proteinet begynder at udfolde sig.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, hvor $\varepsilon$ er opløsningsmidlets dielektricitetskonstant. Vand har en dielektricitetskonstant på 78,4, så dette led er lig med 1 i vand. Opløsningsmidler, der adskiller ladninger mindre effektivt end vand, såsom ethanol, sænker opløseligheden.

Referenceværdier anvendt af beregneren

Opløselighedskategorier

Eksempel: albumin i fosfatbuffer

Find opløseligheden af albumin i fosfatbuffer ved 25 °C, pH 7,4 og en ionstyrke på 0,15 M.

Albumins referenceværdier er $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL og $T_m = 63°C$. Fosfatbuffer har en dielektricitetskonstant på 76,0.

1. pH-led: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Forholdstal: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Ionled: ionstyrken (0,15 M) er lig med referenceværdien, så forholdstallet er 1.
3. Temperaturled: temperaturen (25 °C) er lig med referenceværdien, så forholdstallet er 1.
4. Opløsningsmiddelled: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Beregneren angiver 492,12 mg/mL, hvilket falder i kategorien "meget opløseligt".

Eksempel: lysozym i glycerol ved lav temperatur

Find opløseligheden af lysozym i en glycerolopløsning ved 4 °C, pH 5,0 og en ionstyrke på 0,1 M. Dette svarer omtrent til betingelserne ved kold opbevaring af et enzym.

Lysozyms referenceværdier er $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL og $T_m = 72°C$. Glycerol har en dielektricitetskonstant på 42,5.

1. pH-led: ændringen fra pH 7,0 til pH 5,0 (begge langt under pI på 11,35) ændrer kun pH-leddet en smule. Forholdstal: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Ionled: når ionstyrken sænkes fra 0,15 M til 0,1 M, stiger opløseligheden en smule på grund af salting-in-effekten. Forholdstal: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperaturled: Afkøling fra 25 °C til 4 °C, langt under smeltepunktet, sænker leddet. Forhold: 0,8106.
4. Opløsningsmiddelled: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Beregneren angiver 35,88 mg/mL, hvilket falder i kategorien "opløseligt". Det er glycerols lave dielektricitetskonstant, ikke den lave temperatur, der trækker resultatet ned fra referenceværdien.

Sådan bruges beregneren for proteinopløselighed

1. Vælg et protein fra listen: albumin, insulin, lysozym, hæmoglobin, myoglobin, kollagen, kasein eller fibrinogen.
2. Vælg et opløsningsmiddel: vand, fosfatbuffer, Tris-buffer, glycerol, DMSO, methanol, ethanol eller acetone.
3. Indtast temperaturen i °C (0 til 100), pH-værdien (0 til 14) og ionstyrken i molar (0 til 2).
4. Aflæs den beregnede opløselighed i mg/mL og dens kategori. En bjælke under resultatet viser værdien på en skala fra 0 til 100 mg/mL og udfyldes helt ved 100 mg/mL eller mere.

Hvad påvirker proteinopløselighed

pH og det isoelektriske punkt. Alle proteiner har et isoelektrisk punkt, den pH-værdi hvor deres overflade ikke har nogen nettoladning. Ved denne pH-værdi frastøder proteinmolekylerne ikke hinanden, så de klumper sammen og falder lettere ud af opløsningen. Når pH-værdien flyttes væk fra det isoelektriske punkt i den ene eller den anden retning, får proteinet en nettoladning. Ladede molekyler frastøder hinanden, hvilket holder dem adskilt og opløst.

Ionstyrke. Opløste saltioner omgiver et proteins ladede overfladegrupper. Ved lave til moderate koncentrationer afskærmer disse ioner ladninger, som ellers ville tiltrække to proteinmolekyler til hinanden, og det øger opløseligheden. Dette kaldes salting in. Ved høje saltkoncentrationer konkurrerer ionerne med proteinet om vandmolekylerne og fjerner det vandlag, der holder proteinet opløst. Dette kaldes salting out og danner grundlag for en almindelig oprensningsmetode, hvor ammoniumsulfat bruges til at udfælde proteiner fra en blanding.

Temperatur. Opvarmning af en opløsning øger generelt opløseligheden op til et vist punkt. Når temperaturen nærmer sig et proteins smeltepunkt, begynder proteinet at udfolde sig. Udfoldningen blotlægger hydrofobe (vandafvisende) dele af proteinet, som normalt er skjult inde i dets foldede struktur. De blotlagte dele klæber til hinanden og forårsager aggregering, så opløseligheden falder kraftigt nær og over smeltepunktet.

Opløsningsmiddel. Et opløsningsmiddels dielektricitetskonstant måler, hvor effektivt det svækker den elektriske tiltrækning mellem ladede partikler. Vand har en høj dielektricitetskonstant og adskiller ladninger godt, hvilket er grunden til, at de fleste proteiner opløses bedre i vand end i organiske opløsningsmidler som ethanol eller acetone. Opløsningsmidler med en lav dielektricitetskonstant lader modsatrettede ladninger på forskellige proteinmolekyler tiltrække hinanden kraftigere, hvilket fremmer aggregering.

Begrænsninger

Beregneren anvender en forenklet model, der bygger på et lille udvalg af referenceproteiner og standardopløsningsmidler. Den tager ikke højde for proteinets renhed, tilsætningsstoffer som detergenter eller stabilisatorer eller usædvanlige bufferkomponenter. Resultaterne er estimater til planlægning af eksperimenter og kan ikke erstatte direkte måling af opløseligheden i laboratoriet.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er proteinopløselighed? Proteinopløselighed er den maksimale koncentration af et protein, der forbliver fuldstændigt opløst i et opløsningsmiddel uden at danne synlige aggregater eller bundfald.

Hvorfor er et protein mindst opløseligt ved det isoelektriske punkt? Ved det isoelektriske punkt har proteinet ingen nettoladning, så proteinmolekylerne ikke længere frastøder hinanden elektrisk. Uden denne frastødning er der større sandsynlighed for, at de klæber sammen og falder ud af opløsningen.

Hvad er forskellen på salting in og salting out? Salting in forekommer ved lave saltkoncentrationer, hvor opløste ioner afskærmer proteinets ladede grupper fra hinanden og øger opløseligheden. Salting out forekommer ved høje saltkoncentrationer, hvor ioner fjerner vand fra proteinets overflade og sænker opløseligheden.

Øger en højere temperatur altid opløseligheden? Nej. Opløseligheden har en tendens til kun at stige med temperaturen op til et vist punkt. Når temperaturen nærmer sig et proteins smeltepunkt, begynder proteinet at udfolde sig, hvilket normalt forårsager aggregering og et kraftigt fald i opløseligheden.

Hvorfor opløses proteiner dårligere i ethanol eller acetone end i vand? Vand har en høj dielektricitetskonstant, hvilket betyder, at det meget effektivt svækker den elektriske tiltrækning mellem ladede dele af proteinmolekyler. Ethanol og acetone har lavere dielektricitetskonstanter, så ladede grupper på forskellige proteinmolekyler tiltrækker hinanden kraftigere i disse opløsningsmidler, hvilket gør aggregering mere sandsynlig.

Hvor nøjagtig er denne beregner? Den giver et estimat baseret på en fysisk model og et lille udvalg af referenceproteiner og opløsningsmidler. Den er nyttig til at indsnævre de betingelser, der skal testes, men eksperimentel måling er fortsat den eneste måde at bekræfte opløseligheden for en bestemt proteinprøve.

Yderligere læsning

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.