محاسبه حجم نمونه جذب BCA

مقدمه

محاسبه حجم نمونه جذب BCA ابزاری تخصصی است که به پژوهشگران و تکنسین‌های آزمایشگاهی کمک می‌کند تا به دقت حجم نمونه مناسب برای آزمایش‌ها را بر اساس نتایج آزمون BCA (اسید بی‌سینکونینیک) تعیین کنند. این محاسبه‌گر خوانش‌های جذب از آزمون BCA شما و جرم نمونه مورد نظر شما را می‌گیرد تا حجم دقیق مورد نیاز برای بارگذاری پروتئین یکسان در کاربردهایی مانند وسترن بلات، آزمون‌های آنزیمی و دیگر تکنیک‌های تجزیه و تحلیل پروتئین را محاسبه کند.

آزمون BCA یکی از رایج‌ترین روش‌ها برای کمی‌سازی پروتئین در آزمایشگاه‌های بیوشیمی و زیست‌شناسی مولکولی است. با اندازه‌گیری جذب نمونه‌های پروتئینی خود و مقایسه آن‌ها با منحنی استاندارد، می‌توانید غلظت پروتئین را با دقت بالا تعیین کنید. محاسبه‌گر ما این فرآیند را با تبدیل خودکار خوانش‌های جذب به حجم‌های نمونه مورد نیاز برای آزمایش‌های شما ساده می‌کند.

درک آزمون BCA و محاسبه حجم نمونه

آزمون BCA چیست؟

آزمون بی‌سینکونینیک (BCA) یک آزمون بیوشیمیایی برای تعیین غلظت کل پروتئین در یک محلول است. اصل این آزمون به تشکیل یک کمپلکس پروتئین-مس Cu²⁺ تحت شرایط قلیایی بستگی دارد، که به دنبال آن کاهش Cu²⁺ به Cu¹⁺ انجام می‌شود. مقدار کاهش به پروتئین موجود متناسب است. BCA در محیط‌های قلیایی با Cu¹⁺ یک کمپلکس بنفش رنگ تشکیل می‌دهد که پایه‌ای برای نظارت بر کاهش مس توسط پروتئین‌ها فراهم می‌کند.

شدت رنگ بنفش به طور متناسب با غلظت پروتئین افزایش می‌یابد که می‌تواند با استفاده از اسپکتروفتومتر در حدود 562 نانومتر اندازه‌گیری شود. سپس خوانش‌های جذب با منحنی استاندارد مقایسه می‌شوند تا غلظت پروتئین در نمونه‌های ناشناخته تعیین شود.

فرمول محاسبه حجم نمونه

فرمول بنیادی برای محاسبه حجم نمونه از نتایج جذب BCA به صورت زیر است:

$\text{حجم نمونه (μL)} = \frac{\text{جرم نمونه (μg)}}{\text{غلظت پروتئین (μg/μL)}}$

که در آن:

حجم نمونه حجم مورد نیاز برای نمونه (به میکرولیتر، μL) است
جرم نمونه مقدار پروتئین مورد نظر برای استفاده (به میکروگرم، μg) است
غلظت پروتئین از خوانش جذب BCA به دست می‌آید (به μg/μL)

غلظت پروتئین از خوانش جذب با استفاده از معادله منحنی استاندارد محاسبه می‌شود:

$\text{غلظت پروتئین (μg/μL)} = \text{شیب} \times \text{جذب} + \text{مقاطع}$

برای یک آزمون BCA استاندارد، شیب معمولاً حدود 2.0 است و مقطع معمولاً نزدیک به صفر است، اگرچه این مقادیر می‌توانند بسته به شرایط خاص آزمون و منحنی استاندارد شما متفاوت باشند.

نحوه استفاده از محاسبه‌گر حجم نمونه جذب BCA

محاسبه‌گر ما فرآیند تعیین حجم‌های نمونه از نتایج آزمون BCA را ساده می‌کند. مراحل زیر را دنبال کنید تا محاسبات دقیقی به دست آورید:

وارد کردن اطلاعات نمونه:
- نامی برای نمونه خود وارد کنید (اختیاری اما برای پیگیری چندین نمونه مفید است)
- خوانش جذب BCA را از اسپکتروفتومتر خود وارد کنید
- جرم نمونه مورد نظر خود را وارد کنید (مقدار پروتئینی که می‌خواهید در μg استفاده کنید)
انتخاب نوع منحنی استاندارد:
- استاندارد (پیش‌فرض): از پارامترهای معمول منحنی استاندارد BCA استفاده می‌کند
- تقویت‌شده: برای پروتکل حساسیت تقویت‌شده
- میکرو: برای پروتکل میکروپلیت
- سفارشی: به شما اجازه می‌دهد تا مقادیر شیب و مقطع خود را وارد کنید
مشاهده نتایج:
- محاسبه‌گر به سرعت حجم مورد نیاز نمونه را به میکرولیتر نمایش می‌دهد
- نتایج همچنین در یک جدول خلاصه برای مرجع آسان ارائه می‌شوند
- برای چندین نمونه، می‌توانید ورودی‌های بیشتری اضافه کنید و نتایج را مقایسه کنید
کپی یا صادرات نتایج:
- از دکمه کپی برای انتقال نتایج به دفترچه آزمایشگاه یا برنامه‌های دیگر استفاده کنید
- تمام محاسبات می‌توانند برای ارجاع آینده ذخیره شوند

مثال گام به گام

بیایید یک مثال عملی را مرور کنیم:

شما یک آزمون BCA انجام داده‌اید و خوانش جذب 0.75 را برای نمونه پروتئینی خود به دست آورده‌اید.
شما می‌خواهید 20 μg پروتئین برای وسترن بلات خود بارگذاری کنید.
با استفاده از منحنی استاندارد (شیب = 2.0، مقطع = 0):
- غلظت پروتئین = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 μg/μL
- حجم نمونه مورد نیاز = 20 μg ÷ 1.5 μg/μL = 13.33 μL

این به این معنی است که شما باید 13.33 μL از نمونه خود را بارگذاری کنید تا 20 μg پروتئین به دست آورید.

درک نتایج

محاسبه‌گر چندین قطعه اطلاعات مهم را ارائه می‌دهد:

غلظت پروتئین: این مقدار از خوانش جذب شما با استفاده از منحنی استاندارد انتخابی محاسبه می‌شود. این مقدار نشان‌دهنده مقدار پروتئین در هر واحد حجم در نمونه شما (μg/μL) است.
حجم نمونه: این مقدار حجم نمونه‌ای است که شامل مقدار مورد نظر پروتئین شما است. این مقدار همان چیزی است که شما هنگام آماده‌سازی آزمایش‌های خود استفاده خواهید کرد.
هشدارها و توصیه‌ها: محاسبه‌گر ممکن است هشدارهایی برای:
- خوانش‌های جذب بسیار بالا (>3.0) که ممکن است خارج از محدوده خطی آزمون باشد
- خوانش‌های جذب بسیار پایین (<0.1) که ممکن است نزدیک به حد تشخیص باشند
- حجم‌های محاسبه‌شده که به طرز غیرعملی بزرگ (>1000 μL) یا کوچک (<1 μL) هستند

کاربردها و موارد استفاده

آماده‌سازی نمونه‌های وسترن بلات

یکی از رایج‌ترین کاربردهای این محاسبه‌گر آماده‌سازی نمونه‌ها برای وسترن بلات است. بارگذاری یکسان پروتئین برای نتایج قابل اعتماد وسترن بلات ضروری است و این محاسبه‌گر اطمینان حاصل می‌کند که شما مقدار یکسانی از پروتئین را برای هر نمونه بارگذاری می‌کنید، حتی زمانی که غلظت‌های آن‌ها متفاوت باشد.

جریان کار مثال:

آزمون BCA را بر روی تمام نمونه‌های پروتئینی خود انجام دهید
مقدار پروتئین یکسانی را برای بارگذاری (معمولاً 10-50 μg) تعیین کنید
از محاسبه‌گر برای تعیین حجم مورد نیاز برای هر نمونه استفاده کنید
حجم‌های مناسب بافر نمونه و عامل کاهنده را اضافه کنید
حجم‌های محاسبه‌شده را بر روی ژل بارگذاری کنید

آزمون‌های آنزیمی

برای آزمون‌های آنزیمی، معمولاً لازم است از مقدار خاصی پروتئین برای استانداردسازی شرایط واکنش در نمونه‌های مختلف یا آزمایشات استفاده کنید.

جریان کار مثال:

غلظت پروتئین را با استفاده از آزمون BCA تعیین کنید
حجم مورد نیاز برای به دست آوردن مقدار پروتئین مورد نظر را محاسبه کنید
این حجم را به مخلوط واکنش خود اضافه کنید
با آزمون آنزیمی خود ادامه دهید

آزمایش‌های ایمنوپرسپیتیشن

در آزمایش‌های ایمنوپرسپیتیشن (IP)، شروع با مقدار یکسانی از پروتئین برای مقایسه نتایج در شرایط مختلف مهم است.

جریان کار مثال:

غلظت پروتئین لیزات سلولی یا بافتی را با استفاده از آزمون BCA اندازه‌گیری کنید
حجم‌های مورد نیاز برای به دست آوردن مقادیر پروتئین برابر (معمولاً 500-1000 μg) را محاسبه کنید
تمام نمونه‌ها را با بافر لیز به همان حجم تنظیم کنید
با انکوباسیون آنتی‌بادی و رسوب ادامه دهید

خالص‌سازی پروتئین

در طول خالص‌سازی پروتئین، معمولاً لازم است غلظت پروتئین و محاسبه بازده‌ها را در مراحل مختلف پیگیری کنید.

جریان کار مثال:

در طول خالص‌سازی، فراکسیون‌ها را جمع‌آوری کنید
بر روی فراکسیون‌های انتخابی آزمون BCA انجام دهید
غلظت پروتئین و مقدار کل پروتئین را تعیین کنید
حجم‌های مورد نیاز برای کاربردهای بعدی را تعیین کنید

ویژگی‌ها و ملاحظات پیشرفته

منحنی‌های استاندارد سفارشی

در حالی که محاسبه‌گر پارامترهای پیش‌فرض برای آزمون‌های استاندارد BCA را ارائه می‌دهد، شما همچنین می‌توانید مقادیر سفارشی را وارد کنید اگر منحنی استاندارد خود را تولید کرده‌اید. این به ویژه زمانی مفید است که:

با نمونه‌های پروتئینی غیر استاندارد کار می‌کنید
از پروتکل‌های BCA اصلاح‌شده استفاده می‌کنید
در حضور مواد که ممکن است با آزمون تداخل کنند کار می‌کنید

برای استفاده از منحنی استاندارد سفارشی:

"سفارشی" را از گزینه‌های منحنی استاندارد انتخاب کنید
مقادیر شیب و مقطع خود را وارد کنید
محاسبه‌گر از این مقادیر برای تمام محاسبات بعدی استفاده خواهد کرد

مدیریت چندین نمونه

محاسبه‌گر به شما این امکان را می‌دهد که چندین نمونه را اضافه کنید و حجم‌های آن‌ها را به طور همزمان محاسبه کنید. این به ویژه زمانی مفید است که نمونه‌ها را برای آزمایش‌هایی که نیاز به بارگذاری پروتئین یکسان در شرایط مختلف دارند آماده می‌کنید.

مزایای پردازش دسته‌ای:

صرفه‌جویی در زمان با محاسبه تمام حجم‌ها به طور همزمان
اطمینان از یکنواختی در تمام نمونه‌های شما
مقایسه آسان غلظت پروتئین بین نمونه‌ها
شناسایی نقاط غیرعادی یا خطاهای اندازه‌گیری ممکن

رسیدگی به موارد خاص

خوانش‌های جذب بسیار بالا

اگر خوانش جذب شما بالای 2.0 باشد، ممکن است خارج از محدوده خطی آزمون BCA باشد. در این موارد:

نمونه خود را رقیق کرده و آزمون BCA را تکرار کنید
به طور جایگزین، از سیستم هشدار محاسبه‌گر استفاده کنید که خوانش‌های مشکل‌ساز بالقوه را علامت‌گذاری می‌کند

خوانش‌های جذب بسیار پایین

برای خوانش‌های جذب زیر 0.1، ممکن است نزدیک به حد تشخیص آزمون باشید که می‌تواند بر دقت تأثیر بگذارد. در نظر بگیرید:

اگر ممکن است، نمونه خود را غلیظ کنید
از یک روش کمی‌سازی پروتئین حساس‌تر استفاده کنید
طراحی آزمایش خود را برای سازگاری با مقادیر پروتئین پایین‌تر تنظیم کنید

حجم‌های محاسبه‌شده غیرعملی بزرگ

اگر محاسبه‌گر حجمی را نشان می‌دهد که برای کاربرد شما بسیار بزرگ است:

در صورت امکان، نمونه پروتئینی خود را غلیظ کنید
اگر آزمایش شما اجازه می‌دهد، مقدار پروتئین مورد نظر خود را به سمت پایین تنظیم کنید
از حداکثر حجم عملی استفاده کنید و مقدار پروتئین واقعی استفاده شده را یادداشت کنید

تاریخچه کمی‌سازی پروتئین و آزمون BCA

کمی‌سازی دقیق پروتئین یک نیاز اساسی در بیوشیمی و زیست‌شناسی مولکولی از زمان ظهور این زمینه‌ها بوده است. روش‌های اولیه به تعیین محتوای نیتروژن وابسته بودند که زمان‌بر و نیاز به تجهیزات تخصصی داشتند.

تکامل روش‌های کمی‌سازی پروتئین

روش کجلدال (1883): یکی از اولین روش‌ها برای کمی‌سازی پروتئین، که بر اساس اندازه‌گیری محتوای نیتروژن است.
آزمون بیوریت (اوایل 1900): این روش به واکنش بین پیوندهای پپتیدی و یون‌های مس در یک محلول قلیایی وابسته است که رنگ بنفش تولید می‌کند.
آزمون لوری (1951): این روش توسط اولیور لوری توسعه یافت و واکنش بیوریت را با معرف فولین-سیوکالتو ترکیب کرد و حساسیت را افزایش داد.
آزمون برادفورد (1976): ماریون برادفورد این روش را با استفاده از رنگ کوماسین برلینت بلو G-250 توسعه داد که به پروتئین‌ها متصل می‌شود و حداکثر جذب را جابجا می‌کند.
آزمون BCA (1985): این روش توسط پل اسمیت و همکارانش در شرکت Pierce Chemical توسعه یافت و برای حل محدودیت‌های روش‌های موجود طراحی شد، به ویژه تداخل ناشی از مواد شیمیایی مختلف که معمولاً در استخراج و خالص‌سازی پروتئین استفاده می‌شوند.

توسعه آزمون BCA

آزمون BCA برای اولین بار در مقاله‌ای در سال 1985 توسط اسمیت و همکاران تحت عنوان "اندازه‌گیری پروتئین با استفاده از اسید بی‌سینکونینیک" توصیف شد. این روش برای رفع محدودیت‌های روش‌های موجود، به ویژه تداخل ناشی از مواد شیمیایی مختلف که معمولاً در استخراج و خالص‌سازی پروتئین استفاده می‌شوند، طراحی شده بود.

نوآوری کلیدی استفاده از بی‌سینکونینیک برای شناسایی یون‌های Cu¹⁺ تولید شده توسط کاهش Cu²⁺ توسط پروتئین‌ها بود که یک کمپلکس بنفش رنگ تولید می‌کند که می‌تواند به صورت اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری شود. این چندین مزیت را فراهم کرد:

حساسیت بالاتر از روش بیوریت
حساسیت کمتر به تداخل از مواد غیرپروتئینی نسبت به روش لوری
سازگاری بهتر با مواد شوینده نسبت به آزمون برادفورد
پروتکل ساده‌تر با مواد و مراحل کمتر

از زمان معرفی آن، آزمون BCA به یکی از رایج‌ترین روش‌های کمی‌سازی پروتئین در آزمایشگاه‌های بیوشیمی و زیست‌شناسی مولکولی در سراسر جهان تبدیل شده است.

مثال‌های کد برای محاسبه حجم نمونه

فرمول اکسل

1=IF(B2<=0,"خطا: جذب نامعتبر",IF(C2<=0,"خطا: جرم نمونه نامعتبر",C2/(2*B2)))
2
3' که در آن:
4' B2 حاوی خوانش جذب است
5' C2 حاوی جرم نمونه مورد نظر به μg است
6' فرمول حجم نمونه مورد نیاز را به μL برمی‌گرداند
7

پیاده‌سازی پایتون

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """محاسبه غلظت پروتئین از جذب با استفاده از منحنی استاندارد."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("جذب نمی‌تواند منفی باشد")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """محاسبه حجم نمونه مورد نیاز بر اساس جذب و جرم مورد نظر."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("جرم نمونه باید مثبت باشد")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("غلظت پروتئین محاسبه‌شده باید مثبت باشد")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# مثال استفاده
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"برای جذب {absorbance} و جرم پروتئین مورد نظر {sample_mass} μg:")
31    print(f"غلظت پروتئین: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"حجم نمونه مورد نیاز: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"خطا: {e}")
35

کد R برای تجزیه و تحلیل

1# تابع برای محاسبه غلظت پروتئین از جذب
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("جذب نمی‌تواند منفی باشد")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# تابع برای محاسبه حجم نمونه
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("جرم نمونه باید مثبت باشد")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("غلظت پروتئین محاسبه‌شده باید مثبت باشد")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# مثال استفاده
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("برای جذب %.2f و جرم پروتئین مورد نظر %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("غلظت پروتئین: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("حجم نمونه مورد نیاز: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("خطا: %s\n", e$message))
39})
40

پیاده‌سازی جاوا اسکریپت

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("جذب نمی‌تواند منفی باشد");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("جرم نمونه باید مثبت باشد");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("غلظت پروتئین محاسبه‌شده باید مثبت باشد");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// مثال استفاده
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`برای جذب ${absorbance} و جرم پروتئین مورد نظر ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`غلظت پروتئین: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`حجم نمونه مورد نیاز: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`خطا: ${error.message}`);
37}
38

تجسم منحنی استاندارد

رابطه بین جذب و غلظت پروتئین معمولاً در یک محدوده خاص خطی است. در زیر تجسمی از منحنی استاندارد BCA آورده شده است:

<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>

0.0

<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

جذب (562 نانومتر) غلظت پروتئین (μg/μL)

منحنی استاندارد نمونه‌های استاندارد

منحنی استاندارد BCA

مقایسه با سایر روش‌های کمی‌سازی پروتئین

روش‌های مختلف کمی‌سازی پروتئین مزایا و محدودیت‌های مختلفی دارند. در اینجا نحوه مقایسه آزمون BCA با سایر روش‌های رایج آورده شده است:

روش	محدوده حساسیت	مزایا	محدودیت‌ها	بهترین برای
آزمون BCA	5-2000 μg/mL	• سازگاری با مواد شوینده • تغییرات پروتئین به پروتئین کمتر • توسعه رنگ پایدار	• تداخل با عوامل کاهنده • تحت تأثیر برخی عوامل ش chelating	• کمی‌سازی عمومی پروتئین • نمونه‌های حاوی مواد شوینده
آزمون برادفورد	1-1500 μg/mL	• سریع (2-5 دقیقه) • مواد تداخلی کمی	• تغییرات پروتئین به پروتئین بالا • ناسازگار با مواد شوینده	• اندازه‌گیری‌های سریع • نمونه‌های بدون مواد شوینده
روش لوری	1-1500 μg/mL	• معتبر و شناخته‌شده • حساسیت خوب	• تداخل با مواد زیادی • مراحل متعدد	• ثبات تاریخی • نمونه‌های خالص پروتئین
جذب UV (280 نانومتر)	20-3000 μg/mL	• غیر مخرب • بسیار سریع • نیازی به مواد شیمیایی نیست	• تحت تأثیر اسیدهای نوکلئیک • نیاز به نمونه‌های خالص	• محلول‌های خالص پروتئین • بررسی‌های سریع در طول خالص‌سازی
فلورومتریک	0.1-500 μg/mL	• بالاترین حساسیت • دامنه دینامیکی وسیع	• مواد شیمیایی گران‌قیمت • نیاز به فلورومتر	• نمونه‌های بسیار رقیق • حجم نمونه محدود

سوالات متداول

آزمون BCA برای چه استفاده می‌شود؟

آزمون BCA (اسید بی‌سینکونینیک) عمدتاً برای کمی‌سازی غلظت کل پروتئین در یک نمونه استفاده می‌شود. این آزمون به طور گسترده‌ای در بیوشیمی، زیست‌شناسی سلولی و زیست‌شناسی مولکولی برای کاربردهایی مانند وسترن بلات، آزمون‌های آنزیمی، ایمنوپرسپیتیشن و خالص‌سازی پروتئین استفاده می‌شود.

دقت آزمون BCA چقدر است؟

آزمون BCA به طور کلی در حدود 5-10% زمانی که به درستی انجام شود، دقیق است. دقت آن به چندین عامل بستگی دارد از جمله کیفیت منحنی استاندارد، عدم وجود مواد تداخلی و اینکه آیا ترکیب پروتئین ناشناخته مشابه پروتئین استاندارد استفاده شده است یا خیر.

چه چیزهایی می‌تواند بر نتایج آزمون BCA تأثیر بگذارد؟

چندین ماده می‌توانند بر نتایج آزمون BCA تأثیر بگذارند، از جمله:

عوامل کاهنده (DTT، β-مرکاپتو اتانول، گلوتاتیون)
عوامل ش chelating (EDTA، EGTA)
غلظت‌های بالا از قندهای ساده
لیپیدها
برخی از مواد شوینده در غلظت‌های بالا
ترکیبات آمونیاکی

تفاوت بین آزمون BCA و آزمون برادفورد چیست؟

تفاوت‌های اصلی عبارتند از:

آزمون BCA بیشتر با مواد شوینده و سورفاکتانت‌ها سازگار است
آزمون برادفورد سریع‌تر است (2-5 دقیقه در مقابل 30+ دقیقه برای BCA)
BCA تغییرات پروتئین به پروتئین کمتری دارد
برادفورد به اسیدهای آمینه پایه حساس‌تر است
BCA تحت تأثیر عوامل کاهنده است، در حالی که برادفورد نیست

چرا حجم نمونه محاسبه‌شده من خیلی بزرگ است؟

اگر محاسبه‌گر شما حجم بسیار بزرگی را نشان می‌دهد، معمولاً نشان‌دهنده غلظت پایین پروتئین در نمونه شما است. این می‌تواند به دلیل موارد زیر باشد:

محتوای واقعی پروتئین در نمونه اصلی شما پایین است
از دست رفتن پروتئین در طول آماده‌سازی
خطا در روش آزمون BCA
خوانش جذب نادرست

در نظر بگیرید که نمونه خود را غلیظ کنید یا طراحی آزمایش خود را برای سازگاری با غلظت پایین‌تر پروتئین تنظیم کنید.

آیا می‌توانم از این محاسبه‌گر برای سایر روش‌های کمی‌سازی پروتئین استفاده کنم؟

این محاسبه‌گر به طور خاص برای نتایج آزمون BCA طراحی شده است. در حالی که اصل اساسی (تبدیل غلظت به حجم) برای سایر روش‌ها صدق می‌کند، رابطه بین جذب و غلظت پروتئین بین آزمون‌های مختلف متفاوت است. برای سایر روش‌ها مانند برادفورد یا لوری، شما باید از پارامترهای منحنی استاندارد متفاوتی استفاده کنید.

چگونه با نمونه‌هایی که جذب آن‌ها خارج از محدوده خطی است، برخورد کنم؟

برای خوانش‌های جذب خارج از محدوده خطی (معمولاً >2.0):

نمونه خود را رقیق کرده و آزمون BCA را تکرار کنید
از یک روش کمی‌سازی پروتئین متفاوت استفاده کنید
منحنی استاندارد را برای شامل کردن استانداردهای غلظت بالاتر تنظیم کنید

کدام پروتئین باید به عنوان استاندارد استفاده شود؟

آلبومین سرم گاوی (BSA) رایج‌ترین استاندارد برای آزمون‌های BCA است زیرا:

به راحتی در دسترس و ارزان است
بسیار محلول است
در محلول پایدار است
به خوبی توصیف شده است

با این حال، اگر نمونه‌های شما شامل پروتئین غالبی باشد که به طور قابل توجهی با BSA متفاوت است، در نظر بگیرید که از آن پروتئین به عنوان استاندارد خود استفاده کنید تا نتایج دقیق‌تری به دست آورید.

رنگ توسعه یافته در آزمون BCA چقدر پایدار است؟

رنگ بنفش توسعه یافته در واکنش BCA برای چندین ساعت در دمای اتاق پایدار است و می‌توان آن را در هر زمانی در این دوره اندازه‌گیری کرد. با این حال، برای بهترین نتایج، توصیه می‌شود که تمام استانداردها و نمونه‌ها را در تقریباً همان زمان پس از توسعه رنگ اندازه‌گیری کنید.

آیا می‌توانم منحنی استاندارد را از آزمایش قبلی دوباره استفاده کنم؟

در حالی که از نظر فنی ممکن است از یک منحنی استاندارد دوباره استفاده کنید، برای کمی‌سازی دقیق توصیه نمی‌شود. تغییرات در مواد شیمیایی، شرایط انکوباسیون و کالیبراسیون دستگاه می‌تواند بر رابطه بین جذب و غلظت پروتئین تأثیر بگذارد. برای نتایج قابل اعتماد، هر بار که آزمون را انجام می‌دهید، یک منحنی استاندارد جدید تولید کنید.

مراجع

اسمیت PK، کرون RI، هرمانسون GT و همکاران. "اندازه‌گیری پروتئین با استفاده از اسید بی‌سینکونینیک." بیوشیمی تحلیلی. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
ترمو فیشری. "کیت آزمون پروتئین BCA پییرس." دستورالعمل‌ها. موجود در: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
واکر JM. "آزمون بی‌سینکونینیک (BCA) برای کمی‌سازی پروتئین." در: واکر JM، ویراستار. دفترچه راهنمای پروتئین پروتکل‌ها. اسپرینگر؛ 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
اولسون BJ، مارک‌ول J. "آزمون‌ها برای تعیین غلظت پروتئین." پروتکل‌های جاری در علم پروتئین. 2007;فصل 3:واحد 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
نوبل JE، بیلی MJ. "کمی‌سازی پروتئین." روش‌ها در آنزیم‌شناسی. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

امروز محاسبه‌گر حجم نمونه جذب BCA ما را امتحان کنید!

حالا که اصول پشت کمی‌سازی پروتئین BCA و محاسبه حجم نمونه را درک کرده‌اید، از محاسبه‌گر ما استفاده کنید تا جریان کار آزمایشگاهی خود را ساده کنید. به سادگی خوانش‌های جذب و جرم نمونه مورد نظر خود را وارد کنید تا محاسبات حجم نمونه دقیق و آنی به دست آورید.

چه در حال آماده‌سازی نمونه‌ها برای وسترن بلات، آزمون‌های آنزیمی یا هر آزمایش دیگری بر اساس پروتئین باشید، محاسبه‌گر ما به شما کمک می‌کند تا نتایج یکسان و قابل اعتمادی را تضمین کنید. زمان صرفه‌جویی کنید، خطاها را کاهش دهید و قابلیت تکرار آزمایش‌های خود را با محاسبه‌گر حجم نمونه جذب BCA بهبود بخشید.

محاسبه حجم نمونه جذب BCA برای پروتکل‌های آزمایشگاهی

محاسبه حجم نمونه جذب BCA

standardCurveTitle

ورودی‌های نمونه

نمونه 1

فرمول محاسبه

مستندات

محاسبه حجم نمونه جذب BCA

مقدمه

درک آزمون BCA و محاسبه حجم نمونه

آزمون BCA چیست؟

فرمول محاسبه حجم نمونه

نحوه استفاده از محاسبه‌گر حجم نمونه جذب BCA

مثال گام به گام

درک نتایج

کاربردها و موارد استفاده

آماده‌سازی نمونه‌های وسترن بلات

آزمون‌های آنزیمی

آزمایش‌های ایمنوپرسپیتیشن

خالص‌سازی پروتئین

ویژگی‌ها و ملاحظات پیشرفته

منحنی‌های استاندارد سفارشی

مدیریت چندین نمونه

رسیدگی به موارد خاص

خوانش‌های جذب بسیار بالا

خوانش‌های جذب بسیار پایین

حجم‌های محاسبه‌شده غیرعملی بزرگ

تاریخچه کمی‌سازی پروتئین و آزمون BCA

تکامل روش‌های کمی‌سازی پروتئین

توسعه آزمون BCA

مثال‌های کد برای محاسبه حجم نمونه

فرمول اکسل

پیاده‌سازی پایتون

کد R برای تجزیه و تحلیل

پیاده‌سازی جاوا اسکریپت

تجسم منحنی استاندارد

مقایسه با سایر روش‌های کمی‌سازی پروتئین

سوالات متداول

آزمون BCA برای چه استفاده می‌شود؟

دقت آزمون BCA چقدر است؟

چه چیزهایی می‌تواند بر نتایج آزمون BCA تأثیر بگذارد؟

تفاوت بین آزمون BCA و آزمون برادفورد چیست؟

چرا حجم نمونه محاسبه‌شده من خیلی بزرگ است؟

آیا می‌توانم از این محاسبه‌گر برای سایر روش‌های کمی‌سازی پروتئین استفاده کنم؟

چگونه با نمونه‌هایی که جذب آن‌ها خارج از محدوده خطی است، برخورد کنم؟

کدام پروتئین باید به عنوان استاندارد استفاده شود؟

رنگ توسعه یافته در آزمون BCA چقدر پایدار است؟

آیا می‌توانم منحنی استاندارد را از آزمایش قبلی دوباره استفاده کنم؟

مراجع

امروز محاسبه‌گر حجم نمونه جذب BCA ما را امتحان کنید!

ابزارهای مرتبط

محاسبه حجم مخزن برای مخازن استوانه‌ای، کروی و مستطیلی

محاسبه‌گر حجم به مساحت برای پوشش مایع

محاسبه حجم حفره: حفره‌های استوانه‌ای و مستطیلی

محاسبه‌گر حجم حفره - محاسبه حجم استوانه‌ای به‌طور آنی

محاسبه حجم سلول مکعبی: پیدا کردن حجم از طول لبه

محاسبه کننده ساده ضریب رقیق سازی برای محلول‌های آزمایشگاهی

محاسبه حجم شن: برآورد مواد برای هر پروژه

محاسبه‌گر ضریب جذب دو فوتونی

محاسبه گر مولا: ابزار غلظت محلول