Calculateur de Ligature d'ADN - Calculer les Ratios Insert:Vecteur pour le Clonage Moléculaire

La ligation d’ADN est l’étape du clonage moléculaire au cours de laquelle un fragment d’insert est relié à un vecteur plasmidique par l’ADN ligase T4. Un calculateur de ligation d’ADN détermine combien de microlitres d’ADN d’insert et d’ADN du vecteur il faut mélanger pour que la réaction atteigne un rapport molaire choisi entre l’insert et le vecteur.

Fonctionnement du calculateur

Le calculateur utilise six paramètres : la concentration du vecteur, la longueur du vecteur, la concentration de l’insert, la longueur de l’insert, le rapport molaire cible entre l’insert et le vecteur, et le volume total de la réaction. Il permet également de définir la quantité d’ADN du vecteur à utiliser, qui est par défaut de 50 nanogrammes (ng). À partir de ces valeurs, il calcule le volume de vecteur à pipeter, le volume d’insert à pipeter et la quantité de tampon ou d’eau à ajouter pour atteindre le volume total de la réaction.

La concentration est mesurée en nanogrammes par microlitre (ng/μL), généralement à l’aide d’un instrument Nanodrop ou Qubit. La longueur est mesurée en paires de bases (bp). Un kilobase (kb) équivaut à 1000 paires de bases. Le rapport molaire indique combien de molécules d’insert doivent être présentes pour chaque molécule de vecteur. Il ne s’agit pas d’un rapport de masses.

Pourquoi utiliser un rapport molaire plutôt qu’un rapport de masses

Des masses égales d’ADN ne contiennent pas un nombre égal de molécules. Un insert court pèse moins qu’un vecteur long pour un même nombre de molécules. Mélanger des quantités égales en nanogrammes d’un insert court et d’un vecteur long laisserait beaucoup trop peu de molécules d’insert par rapport aux molécules de vecteur. Le calculateur ajuste la masse de l’insert en fonction du rapport des longueurs des fragments, afin que le mélange final contienne le nombre prévu de molécules d’insert par molécule de vecteur.

Formule de la ligation de l’ADN

La quantité d’ADN d’insert nécessaire, en nanogrammes, est :

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

où $m_i$ est la quantité d'insert en nanogrammes, $m_v$ la quantité de vecteur en nanogrammes, $k_i$ la longueur de l'insert en kilobases, $k_v$ la longueur du vecteur en kilobases, et R le rapport molaire cible de l'insert au vecteur.

Une fois cette quantité connue, le calculateur convertit chaque quantité en un volume pouvant être pipeté :

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

où $V_v$ et $V_i$ sont les volumes du vecteur et de l'insert en microlitres, $c_v$ et $c_i$ les concentrations du vecteur et de l'insert en nanogrammes par microlitre, $V_b$ le volume du tampon, et $V_t$ le volume total de la réaction.

Si les volumes du vecteur et de l’insert réunis sont supérieurs au volume total de la réaction, il ne reste plus de place pour le tampon, la ligase ou l’eau. Dans ce cas, le calculateur indique que le volume total est trop faible au lieu d’afficher une quantité négative de tampon.

Exemple détaillé

Un chercheur clone un fragment de gène de 1 kb dans un vecteur plasmidique de 3 kb. Le protocole prévoit d’utiliser 50 ng d’ADN vectoriel avec un rapport molaire insert:vecteur de 3:1, dans une réaction de 20 μL.

Paramètres :

• Concentration du vecteur : 50 ng/μL
• Longueur du vecteur : 3000 bp (3 kb)
• Concentration de l’insert : 25 ng/μL
• Longueur de l’insert : 1000 bp (1 kb)
• Rapport molaire : 3
• Volume total : 20 μL
• Quantité de vecteur : 50 ng

Étape 1 : quantité d’insert

ng d’insert = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Étape 2 : volumes

Volume de vecteur = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volume d’insert = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volume de tampon = 20 − 1 − 2 = 17 μL

La réaction contient 1 μL de vecteur, 2 μL d’insert et 17 μL de tampon ou d’eau, auxquels sont également ajoutés la ligase et son tampon de réaction. Ce mélange fournit trois molécules d’insert pour chaque molécule de vecteur.

Rapports molaires courants pour la ligation

La plupart des clonages standard avec des extrémités cohésives utilisent un rapport insert:vecteur de 3:1. Les ligations qui relient des extrémités franches sont moins efficaces ; un rapport plus élevé, tel que 5:1, est donc courant. Les inserts très volumineux fonctionnent parfois mieux avec un rapport plus faible, proche de 1:1, car les grands fragments apportent déjà de nombreuses paires de bases par molécule.

Foire aux questions

Qu’est-ce que la ligation de l’ADN ?

La ligation d’ADN consiste à relier deux fragments d’ADN, généralement un vecteur plasmidique et un insert, pour former une seule molécule continue. L’ADN ligase T4 scelle la jonction entre les extrémités des fragments.

Que signifie le rapport molaire insert:vecteur ?

Il s’agit du nombre de molécules d’ADN de l’insert présentes pour chaque molécule de vecteur dans la réaction. Un rapport de 3:1 signifie trois molécules d’insert pour chaque molécule de vecteur, quelles que soient leurs masses respectives.

Pourquoi ne pas utiliser des quantités égales en nanogrammes de vecteur et d’insert ?

Les fragments d’ADN de longueurs différentes ont des masses différentes par molécule. Un insert de 1 kb pèse environ un tiers du poids d’un vecteur de 3 kb, molécule par molécule. Des quantités égales en nanogrammes ne donneraient pas un nombre égal de molécules ; le calculateur ajuste donc la masse de l’insert pour atteindre le rapport molaire cible.

Que signifie un volume total trop faible ?

Cela signifie que les volumes du vecteur et de l’insert occupent déjà à eux seuls tout le volume de la réaction, sans laisser de place pour le tampon ou la ligase. Il faut alors augmenter le volume total de la réaction ou utiliser des solutions d’ADN plus concentrées.

Ce calculateur peut-il être utilisé pour le clonage par assemblage de Gibson ou par Golden Gate ?

Non. Ces méthodes utilisent une chimie réactionnelle différente et visent généralement des quantités équimolaires de tous les fragments plutôt qu’un rapport insert:vecteur fixe. Leurs calculs de volume diffèrent de ceux du clonage standard par ligation avec la ligase T4.

Quelle quantité d’ADN vectoriel utilise-t-on généralement ?

50 ng constitue une quantité de départ courante pour une réaction de ligation standard. Les laboratoires utilisent également des quantités comprises entre 25 et 100 ng, ajustées en fonction de la concentration de l’ADN et de l’échelle de la réaction.