DNA ઍનીલિંગ તાપમાન કૅલ્ક્યુલેટર | મફત PCR Tm સાધન

DNA એનીલિંગ તાપમાન ગણક શું છે?

DNA એનીલિંગ તાપમાન ગણક, તેના ક્રમ પરથી DNA પ્રાઇમરનું ગલન તાપમાન (Tm) અંદાજે નક્કી કરે છે. Tm એ તે તાપમાન છે, જેના પર પ્રાઇમરના અડધા અણુઓ તેમના લક્ષ્ય તંતુ સાથે જોડાયેલા હોય છે અને અડધા જોડાયેલા ન હોય. પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (PCR)માં આ મૂલ્ય DNA ટેમ્પલેટ સાથે પ્રાઇમરો જોડાય તે માટે વપરાતા તાપમાનનું માર્ગદર્શન આપે છે.

PCRમાં એનીલિંગ તાપમાન શા માટે મહત્વનું છે

PCR વારંવાર ગરમ અને ઠંડા કરવાના ચક્રો દ્વારા DNAના લક્ષ્ય ભાગની નકલો બનાવે છે. દરેક ચક્રમાં ત્રણ તબક્કા હોય છે. પ્રથમ, લગભગ 95 °C તાપમાને ગરમી ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ટેમ્પલેટને અલગ કરે છે. આ તબક્કાને ડિનેચરેશન કહે છે. બીજું, પ્રતિક્રિયા એનીલિંગ તાપમાન સુધી, સામાન્ય રીતે 50 °C અને 65 °Cની વચ્ચે, ઠંડી થાય છે, જેથી ટૂંકા પ્રાઇમરો એકલ-તંતુઓ પરના અનુરૂપ ક્રમો સાથે બંધાઈ શકે. ત્રીજું, તાપમાન લગભગ 72 °C સુધી વધે છે અને DNA પોલિમરેઝ નામનું એન્ઝાઇમ પ્રાઇમરોને વિસ્તારીને નવા DNA તંતુઓ બનાવે છે.

એનીલિંગ તાપમાન ઘણું ઓછું હોય તો પ્રાઇમરો આંશિક રીતે જ મેળ ખાતા ક્રમો સાથે જોડાય છે અને વધારાના અનિચ્છનીય DNA ખંડો ઉત્પન્ન થાય છે. તાપમાન ઘણું ઊંચું હોય તો પ્રાઇમરો ટેમ્પલેટ સાથે સ્થિર જોડાણ બનાવી શકતા નથી અને બહુ ઓછું અથવા બિલકુલ DNA નકલાતું નથી. PCR પ્રતિક્રિયા નિષ્ફળ જાય ત્યારે સંશોધકો સૌપ્રથમ જે સેટિંગ્સમાં ફેરફાર કરે છે તેમાં એનીલિંગ તાપમાનનો સમાવેશ થાય છે.

GC સામગ્રી Tmને કેવી રીતે અસર કરે છે

પ્રાઇમર હાઇડ્રોજન બંધો દ્વારા તેના લક્ષ્ય સાથે જોડાય છે. ગ્વાનિન-સાયટોસિન (G-C) જોડી ત્રણ હાઇડ્રોજન બંધ બનાવે છે. એડેનિન-થાઇમિન (A-T) જોડી બે બનાવે છે. વધુ G અને C બેઝ ધરાવતા પ્રાઇમરને અલગ કરવા વધુ ગરમી જરૂરી હોય છે, તેથી સમાન લંબાઈના વધુ A અને T બેઝ ધરાવતા પ્રાઇમર કરતાં તેનું Tm વધારે હોય છે. GC સામગ્રી સામાન્ય રીતે ટકાવારી તરીકે લખાય છે: G અને C બેઝની સંખ્યાને કુલ ક્રમની લંબાઈથી ભાગીને 100 વડે ગુણવામાં આવે છે.

DNA એનીલિંગ તાપમાનનું સૂત્ર

આ ગણક પ્રાઇમરની લંબાઈના આધારે બેમાંથી એક સૂત્ર લાગુ કરે છે.

14 ન્યુક્લિયોટાઇડ અથવા તેથી લાંબા પ્રાઇમરો માટે તે Marmur-Doty GC-સામગ્રીનું સૂત્ર વાપરે છે:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

અહીં N_GC એ પ્રાઇમરમાં રહેલા G અને C બેઝની સંખ્યા છે, જેને ટકાવારી તરીકે નહીં પરંતુ સીધી ગણવામાં આવે છે. N એ બેઝની કુલ સંખ્યા છે.

14 ન્યુક્લિયોટાઇડ કરતાં ટૂંકા પ્રાઇમરો માટે તે Wallace નિયમ વાપરે છે:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G અને C પ્રાઇમરમાં રહેલા સંબંધિત બેઝની સંખ્યા દર્શાવે છે.

બંને સૂત્રો સામાન્ય PCR પરિસ્થિતિઓ ધારે છે: આશરે 50 નૅનોમોલર પ્રાઇમર અને 50 મિલિમોલર Na+.

ઉદાહરણ સાથે ગણતરી

19 બેઝ ધરાવતો પ્રાઇમર ATGCTAGCTAGCTGCTAGC લો. તેની લંબાઈ 19 છે, જે 14 અથવા તેથી વધુ છે, તેથી ગણક Marmur-Doty સૂત્ર વાપરે છે.

• લંબાઈ (N) = 19
• Gની સંખ્યા = 5, Cની સંખ્યા = 5, તેથી N_GC = 10, અને GC સામગ્રી 10 / 19 × 100 ≈ 52.6% છે
• Tm = 64.9 + 41 × (10 − 16.4) / 19 = 64.9 + 41 × (−6.4) / 19 = 64.9 − 13.8 ≈ 51.1 °C

સૂત્રમાં GC ટકાવારી 52.6 નહીં, પરંતુ GC ગણતરી 10 વપરાય છે. ભૂલથી ટકાવારી વાપરવાથી Tm આશરે 143 °C આવે છે, જે 50 °C અને 95 °C વચ્ચે ચાલતી PCR પ્રતિક્રિયા માટે વાસ્તવિક મૂલ્ય નથી.

આ કેલ્ક્યુલેટરનો ઉપયોગ કેવી રીતે કરવો

માત્ર A, T, G અને C અક્ષરોનો ઉપયોગ કરીને પ્રાઇમરનો ક્રમ લખો અથવા પેસ્ટ કરો. ગણક ન્યુક્લિયોટાઇડ (nt)માં ક્રમની લંબાઈ, ટકાવારી તરીકે GC સામગ્રી અને ગણતરીથી મેળવેલું એનીલિંગ તાપમાન ડિગ્રી સેલ્સિયસમાં દર્શાવે છે. પરિણામ પ્રયોગશાળાની નોંધો અથવા પ્રોટોકોલ માટે નકલ કરી શકાય છે.

PCR માટે એનીલિંગ તાપમાન પસંદ કરવું

Tm ગણતરીથી મળેલો અંદાજ છે, નિશ્ચિત કાર્યકારી તાપમાન નહીં. ઘણા PCR પ્રોટોકોલમાં વાસ્તવિક એનીલિંગ તબક્કો ગણતરી કરેલા Tm કરતાં થોડા ડિગ્રી નીચે શરૂ કરવામાં આવે છે અને પછી જેલ પરના પરિણામના આધારે ફેરફાર કરવામાં આવે છે. પ્રાઇમરની જોડી માટે સામાન્ય રીતે બંનેમાંથી ઓછું Tm ધરાવતા પ્રાઇમરનું મૂલ્ય પ્રારંભિક બિંદુ તરીકે વપરાય છે. ગ્રેડિયન્ટ PCRમાં એકસાથે વિવિધ તાપમાનની શ્રેણીમાં અનેક પ્રતિક્રિયાઓ ચલાવવામાં આવે છે અને પરીક્ષણ દ્વારા શ્રેષ્ઠ તાપમાન શોધવામાં આવે છે.

Tmનો અંદાજ કાઢવાની અન્ય રીતો

અહીં વપરાયેલા Marmur-Doty અને Wallace સૂત્રો માત્ર બેઝની રચના પર આધારિત ઝડપી અંદાજ છે. અન્ય પદ્ધતિઓ પણ છે:

• નજીકના-પાડોશી ઉષ્માગતિશાસ્ત્રની પદ્ધતિમાં બાજુબાજુ રહેલી દરેક બેઝ જોડી સ્થિરતાને કેવી રીતે અસર કરે છે તેનો હિસાબ કરવામાં આવે છે અને પ્રમાણભૂત પ્રાઇમરો માટે તેને વધુ સચોટ પદ્ધતિ માનવામાં આવે છે.
• ક્ષાર-સમાયોજિત સૂત્રો પ્રતિક્રિયા બફરમાં Na+ અથવા K+ આયનોની સાંદ્રતા માટે સુધારો ઉમેરે છે, કારણ કે વધુ ક્ષાર સાંદ્રતા DNA ડુપ્લેક્સને સ્થિર કરે છે અને Tm વધારે છે.

અલગ સૂત્રો વાપરતા હોવાથી જુદા ગણકો એક જ પ્રાઇમર માટે જુદા Tm મૂલ્યો દર્શાવી શકે છે. PCR ચલાવીને પરિણામ તપાસવું અંતિમ પરીક્ષણ રહે છે.

વારંવાર પૂછાતા પ્રશ્નો

DNA એનીલિંગ તાપમાન શું છે?

PCR દરમિયાન DNA પ્રાઇમરો ટેમ્પલેટ તંતુ પરના તેમના મેળ ખાતા ક્રમ સાથે જોડાય તે તાપમાનને DNA એનીલિંગ તાપમાન કહે છે. પ્રયોગશાળાઓ સામાન્ય રીતે તેને પ્રાઇમરના ગણતરી કરેલા ગલન તાપમાન (Tm) કરતાં થોડા ડિગ્રી નીચે રાખે છે.

પ્રાઇમરનું Tm કેવી રીતે ગણવામાં આવે છે?

14 બેઝ અથવા તેથી લાંબા પ્રાઇમરો માટે, Tm = 64.9 + 41 × (GCની ગણતરી − 16.4) / લંબાઈ. 14 બેઝ કરતાં ટૂંકા પ્રાઇમરો માટે, Tm = 2 × (A+T ગણતરી) + 4 × (G+C ગણતરી).

GC સામગ્રી Tm કેમ વધારે છે?

G-C બેઝ જોડીઓ ત્રણ હાઇડ્રોજન બંધ બનાવે છે, જ્યારે A-T જોડીઓ બે બનાવે છે. G અને C બેઝનો હિસ્સો વધુ ધરાવતા પ્રાઇમરને તેના લક્ષ્યથી અલગ કરવા વધુ ઊર્જા, અને તેથી વધુ તાપમાન, જરૂરી બને છે.

શું PCRનું એનીલિંગ તાપમાન ગણતરી કરેલા Tm જેટલું જ હોવું જોઈએ?

ના. મોટાભાગના પ્રોટોકોલ ગણતરી કરેલા Tm કરતાં કેટલાક ડિગ્રી નીચે શરૂ થાય છે અને ત્યાંથી ફેરફાર કરે છે, કારણ કે Tm એ એવો બિંદુ દર્શાવે છે જ્યાં પ્રાઇમરનો માત્ર અડધો ભાગ જોડાયેલો હોય છે.

શું પ્રાઇમરની લંબાઈ Tm બદલે છે?

હા, જોકે સરળ રીતે નહીં. Marmur-Doty સૂત્રમાં લંબાઈ છેદમાં આવે છે, તેથી સરેરાશ GC સામગ્રી ધરાવતા લાંબા પ્રાઇમરનું Tm આપમેળે ટૂંકા, GC-સમૃદ્ધ પ્રાઇમર કરતાં વધારે હોય એવું જરૂરી નથી.

જુદા Tm ગણકોના પરિણામોમાં ભિન્નતા કેમ હોય છે?

તેઓ જુદા સૂત્રો વાપરે છે. Wallaceનો નિયમ, Marmur-Dotyનું GC-સામગ્રીનું સૂત્ર, નજીકના-પાડોશી ઉષ્માગતિશાસ્ત્ર અને ક્ષાર-સમાયોજિત સૂત્રો એક જ પ્રાઇમર માટે અલગ Tm આપી શકે છે, ક્યારેક તેમાં કેટલાક ડિગ્રીનો તફાવત પણ હોય છે.

સંદર્ભો

1. Marmur J, Doty P. ડિઓક્સિરાઇબોન્યુક્લિક એસિડના ઉષ્મીય ડિનેચરેશન તાપમાન પરથી બેઝ સંઘટનનું નિર્ધારણ. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. phi chi 174 DNA સાથે કૃત્રિમ ઓલિગોડિઓક્સિરાઇબોન્યુક્લિયોટાઇડનું હાઇબ્રિડાઇઝેશન. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. પોલિમર, ડમ્બબેલ અને ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ DNAના નજીકના-પાડોશી ઉષ્માગતિશાસ્ત્રનું એકીકૃત દૃષ્ટિકોણ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.