सीटी मानों और पतला करने वाले कारकों से पीसीआर दक्षता की गणना करें। मानक वक्रों का विश्लेषण करें, संवर्धन दक्षता निर्धारित करें, और अपने मात्रात्मक पीसीआर प्रयोगों को मान्य करें।
मान सकारात्मक होना चाहिए
मान सकारात्मक होना चाहिए
मान सकारात्मक होना चाहिए
मान सकारात्मक होना चाहिए
मान सकारात्मक होना चाहिए
चार्ट उत्पन्न करने के लिए मान्य डेटा दर्ज करें
qPCR दक्षता यह माप है कि PCR प्रतिक्रिया कितनी अच्छी तरह प्रदर्शन करती है। 100% दक्षता का मतलब है कि PCR उत्पाद की मात्रा हर चक्र में दोगुनी हो जाती है जब यह वृद्धि चरण में होती है।
दक्षता मानक वक्र के ढलान से गणना की जाती है, जो Ct मानों को प्रारंभिक टेम्पलेट सांद्रता (पतला श्रृंखला) के लॉग के खिलाफ प्लॉट करके प्राप्त की जाती है।
दक्षता (E) को निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके गणना की जाती है:
E = 10^(-1/slope) - 1
गुणात्मक पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) दक्षता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जो सीधे आपके qPCR प्रयोगों की सटीकता और विश्वसनीयता को प्रभावित करता है। qPCR दक्षता कैलकुलेटर शोधकर्ताओं को यह निर्धारित करने में मदद करता है कि उनके PCR प्रतिक्रियाएँ प्रत्येक थर्मल चक्र के साथ लक्षित DNA अनुक्रमों को कितनी प्रभावी ढंग से बढ़ा रही हैं। आदर्श qPCR प्रतिक्रियाओं की दक्षता 90-110% के बीच होनी चाहिए, जो इंगित करती है कि PCR उत्पाद की मात्रा लगभग हर चक्र के साथ दोगुनी हो जाती है।
खराब वृद्धि दक्षता गलत मात्रात्मकता, अविश्वसनीय परिणामों और दोषपूर्ण प्रयोगात्मक निष्कर्षों की ओर ले जा सकती है। अपनी qPCR दक्षता की गणना और निगरानी करके, आप प्रतिक्रिया की स्थितियों को अनुकूलित कर सकते हैं, प्राइमर डिज़ाइन को मान्य कर सकते हैं, और अपने गुणात्मक PCR डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित कर सकते हैं।
यह कैलकुलेटर मानक वक्र विधि का उपयोग करता है, जो चक्र थ्रेशोल्ड (Ct) मानों को टेम्पलेट सांद्रता (क्रमिक पतलेकरण द्वारा दर्शाया गया) के लघुगणक के खिलाफ प्लॉट करता है, ताकि आपके qPCR परीक्षण की दक्षता निर्धारित की जा सके। इस मानक वक्र का परिणामस्वरूप ढलान का उपयोग फिर दक्षता की गणना के लिए एक सरल गणितीय सूत्र का उपयोग करता है।
qPCR प्रतिक्रिया की दक्षता मानक वक्र के ढलान से निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके गणना की जाती है:
जहाँ:
100% दक्षता (प्रत्येक चक्र के साथ पूर्ण दोगुनी) के साथ एक आदर्श PCR प्रतिक्रिया के लिए, ढलान -3.32 होगा। इसका कारण है:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (या 100%)}
दक्षता प्रतिशत को दशमलव दक्षता को 100 से गुणा करके गणना की जाती है:
\text{Efficiency (%)} = E \times 100\%
मानक वक्र Ct मानों (y-धुरी) को प्रारंभिक टेम्पलेट सांद्रता या पतलेकरण कारक (x-धुरी) के लॉग के खिलाफ प्लॉट करके बनाई जाती है। इन चर के बीच का संबंध रैखिक होना चाहिए, और इस रैखिक संबंध की गुणवत्ता को निर्धारण के गुणांक (R²) का उपयोग करके आंका जाता है।
विश्वसनीय qPCR दक्षता गणनाओं के लिए:
डेटा तैयारी: कैलकुलेटर आपके Ct मानों को प्रत्येक पतलेकरण बिंदु के लिए और पतलेकरण कारक को इनपुट के रूप में लेता है।
लॉग परिवर्तन: पतलेकरण श्रृंखला को लॉग स्केल (लॉग बेस 10) में परिवर्तित किया जाता है।
रेखीय प्रतिगमन: कैलकुलेटर लॉग-परिवर्तित डेटा पर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण करता है ताकि ढलान, y-इंटरसेप्ट, और R² मान निर्धारित किया जा सके।
दक्षता गणना: ढलान मान का उपयोग करते हुए, दक्षता की गणना की जाती है E = 10^(-1/slope) - 1 सूत्र का उपयोग करके।
परिणाम व्याख्या: कैलकुलेटर दक्षता को प्रतिशत के रूप में प्रदर्शित करता है, साथ ही ढलान और R² मान को आपके qPCR परीक्षण की विश्वसनीयता का आकलन करने में मदद करने के लिए।
अपनी qPCR दक्षता की गणना करने के लिए इन चरणों का पालन करें:
पतलेकरणों की संख्या सेट करें: चुनें कि आपके मानक वक्र में कितने पतलेकरण बिंदु हैं (3-7 बिंदुओं के बीच अनुशंसित)।
पतलेकरण कारक दर्ज करें: लगातार नमूनों के बीच उपयोग किए गए पतलेकरण कारक को इनपुट करें (जैसे, 10 के लिए 10-गुणा पतलेकरण श्रृंखला, 5 के लिए 5-गुणा पतलेकरण श्रृंखला)।
Ct मान इनपुट करें: प्रत्येक पतलेकरण बिंदु के लिए Ct मान दर्ज करें। सामान्यतः, पहला पतलेकरण (पतलेकरण 1) टेम्पलेट की सबसे उच्च सांद्रता को समाहित करता है, जिसके परिणामस्वरूप सबसे कम Ct मान होता है।
परिणाम देखें: कैलकुलेटर स्वचालित रूप से गणना करेगा और प्रदर्शित करेगा:
परिणामों की व्याख्या करें: आकलन करें कि आपकी qPCR दक्षता स्वीकार्य सीमा (90-110%) के भीतर है या नहीं और क्या R² मान विश्वसनीय मानक वक्र (≥ 0.98) को इंगित करता है।
परिणाम कॉपी करें: अपने रिकॉर्ड या प्रकाशनों के लिए सभी गणना किए गए मानों को कॉपी करने के लिए "परिणाम कॉपी करें" बटन का उपयोग करें।
आइए एक उदाहरण के माध्यम से चलते हैं:
जब मानक वक्र पर प्लॉट किया जाता है:
कैलकुलेटर रेखीय प्रतिगमन करेगा और निर्धारित करेगा:
दक्षता सूत्र का उपयोग करते हुए:
यह 93% की अच्छी qPCR दक्षता को दर्शाता है, जो स्वीकार्य सीमा (90-110%) के भीतर है।
किसी नए प्राइमर जोड़ी का उपयोग गुणात्मक प्रयोगों के लिए करने से पहले, इसके प्रदर्शन को मान्य करना आवश्यक है। qPCR दक्षता की गणना करने में मदद करती है:
नए qPCR परीक्षणों के विकास में, दक्षता गणनाएँ महत्वपूर्ण हैं:
सापेक्ष मात्रात्मकता प्रयोगों में, PCR दक्षता जानना आवश्यक है:
नैदानिक और परीक्षण सेटिंग्स में, qPCR दक्षता महत्वपूर्ण है:
पर्यावरण और खाद्य सुरक्षा अनुप्रयोगों के लिए, दक्षता गणनाएँ मदद करती हैं:
हालांकि मानक वक्र विधि दक्षता की गणना के लिए सबसे सामान्य दृष्टिकोण है, इसके कुछ वैकल्पिक तरीके हैं:
यह विधि एकल वृद्धि वक्र के फ्लोरोसेंस डेटा से दक्षता की गणना करती है, बिना पतलेकरण श्रृंखला की आवश्यकता के। LinRegPCR जैसे सॉफ़्टवेयर व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं के गुणनात्मक चरण का विश्लेषण करके दक्षता निर्धारित करते हैं।
लाभ:
हानियाँ:
डिजिटल PCR (dPCR) पूर्ण मात्रात्मकता प्रदान करता है बिना मानक वक्र या दक्षता गणनाओं की आवश्यकता के।
लाभ:
हानियाँ:
कुछ qPCR विश्लेषण सॉफ़्टवेयर तुलनात्मक मात्रात्मकता विधियों की पेशकश करते हैं जो पूर्ण मानक वक्र के बिना दक्षता का अनुमान लगाते हैं।
लाभ:
हानियाँ:
qPCR और दक्षता गणनाओं का विकास पिछले कुछ दशकों में काफी महत्वपूर्ण रूप से विकसित हुआ है:
पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) का आविष्कार कैरी मॉलिस ने 1983 में किया था, जिसने आणविक जीवविज्ञान में क्रांति ला दी। हालांकि, पारंपरिक PCR केवल गुणात्मक या अर्ध-गुणात्मक था। 1990 के दशक की शुरुआत में रसेल हिगुची और सहयोगियों द्वारा पहला वास्तविक समय PCR प्रणाली विकसित की गई, जिन्होंने दिखाया कि जैसे-जैसे PCR उत्पाद जमा होते हैं (एथिडियम ब्रोमाइड फ्लोरोसेंस का उपयोग करके) उसे गुणात्मक जानकारी प्रदान की जा सकती है।
जैसे-जैसे qPCR प्रौद्योगिकी में प्रगति हुई, शोधकर्ताओं ने मानकीकरण और मान्यता के महत्व को पहचाना। PCR दक्षता की अवधारणा विश्वसनीय मात्रात्मकता के लिए केंद्रीय बन गई:
यह क्षेत्र निम्नलिखित के साथ विकसित होता रहा है:
आज, qPCR दक्षता की गणना और रिपोर्टिंग को विश्वसनीय qPCR डेटा प्रकाशित करने के लिए आवश्यक माना जाता है, और इस कैलकुलेटर जैसे उपकरण शोधकर्ताओं को क्षेत्र में सर्वोत्तम प्रथाओं का पालन करने में मदद करते हैं।
1' Excel सूत्र दक्षता की गणना के लिए ढलान से
2' यदि ढलान सेल A2 में है तो सेल B2 में रखें
3=10^(-1/A2)-1
4
5' दक्षता को प्रतिशत में परिवर्तित करने के लिए Excel सूत्र
6' यदि दक्षता दशमलव सेल B2 में है तो सेल C2 में रखें
7=B2*100
8
9' Ct मानों और पतलेकरण कारक से दक्षता की गणना करने के लिए फ़ंक्शन
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' रेखीय प्रतिगमन की गणना करें
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' ढलान की गणना करें
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' दक्षता की गणना करें
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# Ct मानों और पतलेकरण कारक से qPCR दक्षता की गणना करने के लिए R फ़ंक्शन
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # लॉग पतलेकरण मान बनाएं
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # रेखीय प्रतिगमन करें
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # ढलान और R-स्क्वायर निकालें
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # दक्षता की गणना करें
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # परिणाम लौटाएं
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# उदाहरण उपयोग
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("दक्षता: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("ढलान: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-स्क्वायर: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Ct मानों और पतलेकरण कारक से qPCR दक्षता की गणना करें।
8
9 पैरामीटर:
10 ct_values (list): Ct मानों की सूची
11 dilution_factor (float): लगातार नमूनों के बीच पतलेकरण कारक
12
13 लौटाता है:
14 dict: दक्षता, ढलान, r_squared, और इंटरसेप्ट को समाहित करने वाला शब्दकोष
15 """
16 # लॉग पतलेकरण मान बनाएं
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # रेखीय प्रतिगमन करें
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # दक्षता की गणना करें
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 रेखीय प्रतिगमन रेखा के साथ मानक वक्र को प्लॉट करें।
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # रेखीय प्रतिगमन रेखा के लिए बिंदुओं का उत्पादन करें
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('लॉग पतलेकरण')
48 plt.ylabel('Ct मान')
49 plt.title('qPCR मानक वक्र')
50
51 # प्लॉट में समीकरण और R² जोड़ें
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"दक्षता = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# उदाहरण उपयोग
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"दक्षता: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"ढलान: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-स्क्वायर: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"इंटरसेप्ट: {results['intercept']:.4f}")
73
74# मानक वक्र को प्लॉट करें
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Ct मानों और पतलेकरण कारक से qPCR दक्षता की गणना करें
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct मानों की सरणी
4 * @param {number} dilutionFactor - लगातार नमूनों के बीच पतलेकरण कारक
5 * @returns {Object} दक्षता, ढलान, rSquared, और इंटरसेप्ट को समाहित करने वाला ऑब्जेक्ट
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // लॉग पतलेकरण मान बनाएं
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // रेखीय प्रतिगमन के लिए औसत की गणना करें
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // ढलान और इंटरसेप्ट की गणना करें
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // R-स्क्वायर की गणना करें
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // दक्षता की गणना करें
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// उदाहरण उपयोग
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`दक्षता: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`ढलान: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-स्क्वायर: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`इंटरसेप्ट: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60एक अच्छी qPCR दक्षता सामान्यतः 90% और 110% (0.9-1.1) के बीच होती है। 100% दक्षता का अर्थ है कि PCR उत्पाद हर चक्र के साथ पूरी तरह से दोगुना हो रहा है। इस सीमा के बाहर की दक्षताएँ प्राइमर डिज़ाइन, प्रतिक्रिया की स्थितियों, या अवरोधकों की उपस्थिति में समस्याओं को इंगित कर सकती हैं।
100% से अधिक दक्षता निम्नलिखित कारणों से हो सकती है:
निम्न R² मान (0.98 से कम) आपके मानक वक्र में खराब रैखिकता को दर्शाता है, जो निम्नलिखित कारणों से हो सकता है:
विश्वसनीय दक्षता गणनाओं के लिए, 3 पतलेकरण बिंदुओं की न्यूनतम आवश्यकता होती है, लेकिन अधिक सटीक परिणामों के लिए 5-6 बिंदुओं की सिफारिश की जाती है। ये बिंदु आपके प्रयोगात्मक नमूनों की अपेक्षित टेम्पलेट सांद्रताओं की पूरी गतिशील रेंज को कवर करने चाहिए।
ΔΔCt विधि का उपयोग करते समय, लक्षित और संदर्भ जीनों के बीच समान दक्षताओं का अनुमान लगाया जाता है (आदर्श रूप से 100%)। जब दक्षताएँ महत्वपूर्ण रूप से भिन्न होती हैं:
नहीं, दक्षता को प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए और फिर से मान्य किया जाना चाहिए:
PCR अवरोधक:
शब्द अक्सर एक दूसरे के लिए उपयोग किए जाते हैं, लेकिन:
qPCR दक्षता सुधारने के लिए:
महत्वपूर्ण रूप से भिन्न दक्षताओं के साथ नमूनों की तुलना करना अनुशंसित नहीं है क्योंकि:
बस्टिन एसए, बेनेस वी, गार्सन जेए, एट अल। MIQE दिशानिर्देश: गुणात्मक वास्तविक समय PCR प्रयोगों के प्रकाशन के लिए न्यूनतम जानकारी। क्लिन केम। 2009;55(4):611-622। doi:10.1373/clinchem.2008.112797
पफ्फ़ल एमडब्ल्यू। वास्तविक समय RT-PCR में सापेक्ष मात्रात्मकता के लिए एक नया गणितीय मॉडल। न्यूक्लिक एसिड रिसर्च। 2001;29(9):e45। doi:10.1093/nar/29.9.e45
स्वेक डी, तिचोपैड ए, नोवोसादोवा वी, पफ्फ़ल एमडब्ल्यू, क्यूबिस्टा एम। PCR दक्षता का अच्छा अनुमान कैसे प्राप्त करें: सटीक और विश्वसनीय qPCR दक्षता आकलन के लिए सिफारिशें। बायोमॉल डिटेक्ट क्वांटिफ। 2015;3:9-16। doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
टेलर एससी, नाडेउ के, अब्बासी एम, लाचांस सी, न्गुएन एम, फेनरिच जे। अंतिम qPCR प्रयोग: पहली बार प्रकाशन गुणवत्ता, पुनरुत्पादक डेटा का उत्पादन। ट्रेंड्स बायोटेक्नोल। 2019;37(7):761-774। doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
रुजिटर जेएम, रामाकर्स सी, होगर्स डब्ल्यूएम, एट अल। वृद्धि दक्षता: गुणात्मक PCR डेटा के विश्लेषण में बेसलाइन और पूर्वाग्रह को जोड़ना। न्यूक्लिक एसिड रिसर्च। 2009;37(6):e45। doi:10.1093/nar/gkp045
हिगुची आर, फॉकलर सी, डोलिंगर जी, वॉटसन आर। गतिशील PCR विश्लेषण: DNA वृद्धि प्रतिक्रियाओं की वास्तविक समय निगरानी। बायोटेक्नोलॉजी (एनवाई)। 1993;11(9):1026-1030। doi:10.1038/nbt0993-1026
बायो-रेड प्रयोगशालाएँ। वास्तविक समय PCR अनुप्रयोग गाइड। https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
थर्मो फिशर साइंटिफिक। वास्तविक समय PCR हैंडबुक। https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
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