डीएनए लिगेशन कैलकुलेटर - आणविक क्लोनिंग के लिए इंसर्ट:वेक्टर अनुपात की गणना करें

आणविक क्लोनिंग में DNA लिगेशन वह चरण है जिसमें T4 DNA लाइगेज़ एंज़ाइम द्वारा एक इंसर्ट खंड को प्लाज़्मिड वेक्टर से जोड़ा जाता है। DNA लिगेशन कैलकुलेटर यह निर्धारित करता है कि चुने गए इंसर्ट-से-वेक्टर मोलर अनुपात तक पहुँचने के लिए इंसर्ट DNA और वेक्टर DNA के कितने माइक्रोलिटर मिलाने चाहिए।

कैलकुलेटर क्या करता है

कैलकुलेटर छह इनपुट लेता है: वेक्टर सांद्रता, वेक्टर लंबाई, इंसर्ट सांद्रता, इंसर्ट लंबाई, इंसर्ट-से-वेक्टर लक्ष्य मोलर अनुपात और कुल अभिक्रिया आयतन। यह उपयोगकर्ता को प्रयुक्त किए जाने वाले वेक्टर DNA की मात्रा निर्धारित करने की सुविधा भी देता है, जिसका डिफ़ॉल्ट मान 50 नैनोग्राम (ng) है। इन मानों से यह पिपेट करने योग्य वेक्टर का आयतन, पिपेट करने योग्य इंसर्ट का आयतन और कुल अभिक्रिया आयतन तक पहुँचने के लिए मिलाए जाने वाले बफ़र या पानी की मात्रा की गणना करता है।

सांद्रता नैनोग्राम प्रति माइक्रोलिटर (ng/μL) में मापी जाती है और आमतौर पर Nanodrop या Qubit उपकरण से पढ़ी जाती है। लंबाई बेस पेयर (bp) में मापी जाती है। एक किलोबेस (kb) में 1000 बेस पेयर होते हैं। मोलर अनुपात बताता है कि प्रत्येक एक वेक्टर अणु के लिए कितने इंसर्ट अणु होने चाहिए। यह द्रव्यमान का अनुपात नहीं है।

द्रव्यमान के बजाय मोलर अनुपात का उपयोग क्यों किया जाता है

DNA के समान द्रव्यमान में अणुओं की समान संख्या नहीं होती। समान संख्या में अणुओं के मामले में छोटा इंसर्ट, लंबे वेक्टर से कम वज़न का होता है। छोटे इंसर्ट और लंबे वेक्टर की समान नैनोग्राम मात्रा मिलाने पर, वेक्टर अणुओं की तुलना में इंसर्ट अणु बहुत कम रहेंगे। कैलकुलेटर इंसर्ट के द्रव्यमान को खंडों की लंबाई के अनुपात के अनुसार समायोजित करता है, ताकि अंतिम मिश्रण में प्रत्येक वेक्टर अणु के लिए इच्छित संख्या में इंसर्ट अणु हों।

DNA लिगेशन का सूत्र

नैनोग्राम में आवश्यक इंसर्ट DNA की मात्रा है:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

जहाँ $m_i$ नैनोग्राम में इंसर्ट की मात्रा है, $m_v$ नैनोग्राम में वेक्टर की मात्रा है, $k_i$ किलोबेस में इंसर्ट की लंबाई है, $k_v$ किलोबेस में वेक्टर की लंबाई है और R इंसर्ट-से-वेक्टर का लक्ष्य मोलर अनुपात है।

यह मात्रा ज्ञात होने के बाद, कैलकुलेटर प्रत्येक मात्रा को पिपेट करने योग्य आयतन में बदल देता है:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

जहाँ $V_v$ और $V_i$ माइक्रोलिटर में वेक्टर और इंसर्ट के आयतन हैं, $c_v$ और $c_i$ नैनोग्राम प्रति माइक्रोलिटर में वेक्टर और इंसर्ट की सांद्रताएँ हैं, $V_b$ बफ़र का आयतन है और $V_t$ कुल अभिक्रिया आयतन है।

यदि वेक्टर और इंसर्ट के आयतन का योग कुल अभिक्रिया आयतन से अधिक है, तो बफ़र, लाइगेज़ या पानी के लिए कोई स्थान नहीं बचता। ऐसी स्थिति में कैलकुलेटर ऋणात्मक बफ़र मात्रा दिखाने के बजाय कुल आयतन को बहुत छोटा बताता है।

उदाहरण सहित गणना

एक शोधकर्ता 1 kb के जीन खंड को 3 kb के प्लाज़्मिड वेक्टर में क्लोन कर रहा है। योजना 50 ng वेक्टर DNA को 3:1 इंसर्ट:वेक्टर मोलर अनुपात पर 20 μL की अभिक्रिया में उपयोग करने की है।

इनपुट:

• वेक्टर सांद्रता: 50 ng/माइक्रोलिटर
• वेक्टर लंबाई: 3000 bp (3 kb)
• इंसर्ट सांद्रता: 25 ng/माइक्रोलिटर
• इंसर्ट लंबाई: 1000 bp (1 kb)
• मोलर अनुपात: 3
• कुल आयतन: 20 μL
• वेक्टर की मात्रा: 50 ng

चरण 1: इंसर्ट की मात्रा

इंसर्ट के ng = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

चरण 2: आयतन

वेक्टर का आयतन = 50 ng ÷ 50 ng/माइक्रोलिटर = 1 μL

इंसर्ट का आयतन = 50 ng ÷ 25 ng/माइक्रोलिटर = 2 μL

बफ़र का आयतन = 20 − 1 − 2 = 17 μL

अभिक्रिया में 1 μL वेक्टर, 2 μL इंसर्ट और 17 μL बफ़र या पानी होता है; इसी में लाइगेज़ और उसका अभिक्रिया बफ़र भी मिलाया जाता है। इस मिश्रण में प्रत्येक वेक्टर अणु के लिए तीन इंसर्ट अणु होते हैं।

लिगेशन के सामान्य मोलर अनुपात

चिपकने वाले, बाहर निकले हुए सिरों वाले अधिकांश मानक क्लोनिंग कार्यों में 3:1 इंसर्ट:वेक्टर अनुपात का उपयोग किया जाता है। ब्लंट सिरों को जोड़ने वाले लिगेशन कम दक्ष होते हैं, इसलिए 5:1 जैसा अधिक अनुपात सामान्य है। बहुत बड़े इंसर्ट कभी-कभी 1:1 के निकट कम अनुपात पर बेहतर काम करते हैं, क्योंकि बड़े खंड पहले ही प्रति अणु कई बेस पेयर का योगदान देते हैं।

अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न

DNA लिगेशन क्या है?

DNA लिगेशन दो DNA खंडों, आमतौर पर एक प्लाज़्मिड वेक्टर और एक इंसर्ट, को जोड़कर एक सतत अणु बनाने की प्रक्रिया है। T4 DNA लाइगेज़ एंज़ाइम दोनों खंडों के सिरों के बीच के जोड़ को सील करता है।

इंसर्ट:वेक्टर मोलर अनुपात का क्या अर्थ है?

इसका अर्थ है कि अभिक्रिया में प्रत्येक एक वेक्टर अणु के लिए कितने इंसर्ट DNA अणु मौजूद हैं। 3:1 अनुपात का अर्थ है प्रत्येक वेक्टर अणु के लिए तीन इंसर्ट अणु, चाहे उनके द्रव्यमान की तुलना कैसी भी हो।

वेक्टर और इंसर्ट की समान नैनोग्राम मात्रा का उपयोग क्यों न करें?

अलग-अलग लंबाई वाले DNA खंडों का प्रति अणु द्रव्यमान अलग-अलग होता है। 1 kb का इंसर्ट, अणु-दर-अणु, 3 kb के वेक्टर से लगभग एक-तिहाई वज़न का होता है। दोनों की समान नैनोग्राम मात्रा में अणुओं की संख्या समान नहीं होगी, इसलिए कैलकुलेटर लक्ष्य मोलर अनुपात से मेल कराने के लिए इंसर्ट के द्रव्यमान को समायोजित करता है।

कुल आयतन बहुत छोटा होने का क्या अर्थ है?

इसका अर्थ है कि केवल वेक्टर और इंसर्ट के आयतन से ही पूरा अभिक्रिया आयतन भर गया है और बफ़र या लाइगेज़ के लिए कोई स्थान नहीं बचा। इसका समाधान कुल अभिक्रिया आयतन बढ़ाना या अधिक सांद्र DNA स्टॉक का उपयोग करना है।

क्या इस कैलकुलेटर का उपयोग Gibson Assembly या Golden Gate क्लोनिंग के लिए किया जा सकता है?

नहीं। इन विधियों में अलग अभिक्रिया रसायन का उपयोग होता है और आमतौर पर एक निश्चित इंसर्ट:वेक्टर अनुपात के बजाय सभी खंडों की सममोलर मात्राओं को लक्ष्य बनाया जाता है। इनके आयतन की गणना मानक T4 लाइगेज़ क्लोनिंग से अलग होती है।

आमतौर पर कितने वेक्टर DNA का उपयोग किया जाता है?

मानक लिगेशन अभिक्रिया के लिए 50 ng एक सामान्य प्रारंभिक मात्रा है। प्रयोगशालाएँ 25 से 100 ng तक की मात्राएँ भी उपयोग करती हैं, जिन्हें DNA सांद्रता और अभिक्रिया के पैमाने के अनुसार समायोजित किया जाता है।