DNA 연결 계산기 - 분자 클로닝을 위한 삽입물:벡터 비율 계산

DNA 연결은 분자 클로닝에서 효소 T4 DNA 리가아제를 사용해 삽입 절편을 플라스미드 벡터에 연결하는 단계이다. DNA 연결 계산기는 반응이 선택한 삽입체 대 벡터의 몰비에 도달하도록 혼합해야 하는 삽입 DNA와 벡터 DNA의 부피(마이크로리터)를 계산한다.

계산기의 기능

이 계산기에는 벡터 농도, 벡터 길이, 삽입체 농도, 삽입체 길이, 목표 삽입체 대 벡터 몰비, 총 반응 부피의 여섯 가지 입력값이 필요하다. 또한 사용할 벡터 DNA의 양을 설정할 수 있으며, 기본값은 50나노그램(ng)이다. 이 값들을 바탕으로 피펫으로 취할 벡터 부피와 삽입체 부피, 그리고 총 반응 부피에 맞추기 위해 첨가할 완충액 또는 물의 양을 계산한다.

농도는 보통 Nanodrop 또는 Qubit 기기로 측정하며, 단위는 마이크로리터당 나노그램(ng/μL)이다. 길이의 단위는 염기쌍(bp)이다. 킬로베이스(kb)는 1000 염기쌍과 같다. 몰비는 벡터 분자 하나당 몇 개의 삽입체 분자가 존재해야 하는지를 나타낸다. 이는 질량의 비가 아니다.

질량이 아니라 몰비를 사용하는 이유

DNA의 질량이 같아도 분자 수가 같은 것은 아니다. 같은 수의 분자를 비교하면 짧은 삽입체는 긴 벡터보다 질량이 작다. 짧은 삽입체와 긴 벡터를 같은 나노그램 양으로 혼합하면 벡터 분자에 비해 삽입체 분자가 지나치게 적어진다. 계산기는 절편 길이의 비율에 따라 삽입체의 질량을 조정하여, 최종 혼합물에 벡터 분자 하나당 의도한 수의 삽입체 분자가 포함되도록 한다.

DNA 연결 공식

필요한 삽입 DNA의 양(나노그램)은 다음과 같다.

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

여기서 $m_i$는 삽입체의 양(나노그램 단위), $m_v$는 벡터의 양(나노그램 단위), $k_i$는 삽입체의 길이(킬로베이스 단위), $k_v$는 벡터의 길이(킬로베이스 단위)이며, R은 삽입체와 벡터의 목표 몰비이다.

이 양을 알면 계산기는 각 양을 피펫으로 취할 수 있는 부피로 변환한다.

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

여기서 $V_v$와 $V_i$는 각각 벡터와 삽입체의 부피(마이크로리터 단위)이고, $c_v$와 $c_i$는 각각 벡터와 삽입체의 농도(마이크로리터당 나노그램 단위)이며, $V_b$는 완충액의 부피, $V_t$는 총 반응 부피이다.

벡터 부피와 삽입체 부피의 합이 총 반응 부피보다 크면 완충액, 리가아제 또는 물을 넣을 공간이 남지 않는다. 이 경우 계산기는 음수의 완충액 양을 표시하는 대신 총 부피가 너무 작다고 보고한다.

풀이 예시

한 연구자가 1kb 유전자 절편을 3kb 플라스미드 벡터에 클로닝하려 한다. 50 ng의 벡터 DNA를 삽입체:벡터 몰비 3:1로 사용하고, 반응 부피는 20 μL로 할 계획이다.

입력값:

• 벡터 농도: 50 ng/μL
• 벡터 길이: 3000bp (3kb)
• 삽입체 농도: 25 ng/μL
• 삽입체 길이: 1000bp (1kb)
• 몰비: 3
• 총 부피: 20 μL
• 벡터 양: 50 ng

단계 1: 삽입체 양

삽입체의 ng = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

단계 2: 부피

벡터 부피 = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

삽입체 부피 = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

완충액 부피 = 20 − 1 − 2 = 17 μL

반응 혼합물은 벡터 1 μL, 삽입체 2 μL, 완충액 또는 물 17 μL로 구성되며, 리가아제와 그 반응 완충액도 여기에 첨가한다. 이 혼합물은 벡터 분자 하나당 삽입체 분자 세 개가 되도록 한다.

연결 반응에서 일반적으로 사용하는 몰비

점착성 말단처럼 서로 겹쳐지는 말단을 사용하는 대부분의 표준 클로닝에서는 삽입체:벡터 비율 3:1을 사용한다. 평활 말단을 연결하는 반응은 효율이 낮으므로 5:1과 같이 더 높은 비율이 일반적이다. 매우 큰 삽입체는 분자 하나당 이미 많은 염기쌍을 포함하므로 1:1에 가까운 더 낮은 비율에서 더 잘 작동하기도 한다.

자주 묻는 질문

DNA 연결이란 무엇인가?

DNA 연결은 일반적으로 플라스미드 벡터와 삽입체인 두 DNA 절편을 하나의 연속된 분자로 연결하는 과정이다. T4 DNA 리가아제 효소가 절편 말단 사이의 연결 부위를 봉합한다.

삽입체:벡터 몰비란 무엇을 의미하는가?

반응에서 벡터 분자 하나당 존재하는 삽입 DNA 분자의 수를 의미한다. 3:1 비율은 질량이 서로 어떻게 비교되는지와 관계없이 벡터 분자 하나당 삽입체 분자 세 개를 뜻한다.

벡터와 삽입체를 같은 나노그램 양으로 사용하지 않는 이유?

길이가 다른 DNA 절편은 분자당 질량이 서로 다르다. 1kb 삽입체는 분자 하나를 기준으로 3kb 벡터의 약 삼분의 일 정도 질량이다. 두 물질을 같은 나노그램 양으로 사용하면 분자 수가 같아지지 않으므로, 계산기는 목표 몰비에 맞게 삽입체 질량을 조정한다.

총 부피가 너무 작다는 것은 무엇을 의미하는가?

벡터와 삽입체의 부피만으로 이미 전체 반응 부피를 사용해 완충액이나 리가아제를 넣을 공간이 없다는 뜻이다. 총 반응 부피를 늘리거나 더 농축된 DNA 저장액을 사용하면 해결할 수 있다.

이 계산기를 Gibson Assembly 또는 Golden Gate 클로닝에 사용할 수 있는가?

사용할 수 없다. 이 방법들은 서로 다른 반응 화학을 사용하며, 일반적으로 고정된 삽입체:벡터 비율이 아니라 모든 절편을 등몰량으로 맞춘다. 이들의 부피 계산은 표준 T4 리가아제 클로닝과 다르다.

일반적으로 벡터 DNA를 얼마나 사용하는가?

표준 연결 반응에서는 50 ng이 흔히 사용하는 시작량이다. 실험실에서는 DNA 농도와 반응 규모에 따라 25~100 ng의 양도 사용한다.