Fermento Aktyvumo Skaičiuoklė - Michaelis-Menten Kinetika

Fermento aktyvumo skaičiuoklė

Fermento aktyvumo skaičiuoklė apskaičiuoja, kaip greitai fermentas paverčia substratą produktu; rezultatas išreiškiamas specifiniu aktyvumu vienetais miligramui (U/mg). Joje naudojama Michaelio–Menteno lygtis, standartinis fermentų kinetikos modelis, taip pat mėginyje esančio fermento baltymo kiekis.

Fermentai yra baltymai, pagreitinantys chemines reakcijas ląstelėse, patys nesunaudojami. Mokslininkai matuoja fermento aktyvumą, kad galėtų palyginti skirtingas partijas, patikrinti, ar pavyko gryninimo etapas, arba ištirti, kaip vaistas keičia fermento reakcijos greitį. Vien fermento koncentracija neparodo, ar fermentas atlieka savo funkciją. Tai parodo specifinis aktyvumas.

Ką apskaičiuoja skaičiuoklė

Įrankis naudoja penkis įvesties duomenis: fermento koncentraciją, substrato koncentraciją, Michaelio konstantą (Km), didžiausiąjį greitį (Vmax) ir reakcijos trukmę. Reakcijos trukmė įrašoma informaciniais tikslais, tačiau į formulę neįtraukiama. Vmax jau yra greitis – per minutę paverčiamo substrato kiekis, todėl laikas į jį jau įskaičiuotas. Dar kartą dalijant iš laiko, jis būtų įskaičiuotas du kartus.

Skaičiuoklė pateikia vieną skaičių ir vieną grafiką:

• Specifinis aktyvumas, U/mg. Tai reakcijos greitis, padalytas iš esančio fermento baltymo kiekio.
• Reakcijos greičio priklausomybės nuo substrato koncentracijos grafikas, kuriame pavaizduotos mažos substrato koncentracijos, pereinamoji ir prisotinta kreivės dalys. Jame pažymėtas greitis, atitinkantis įvestą substrato koncentraciją.

Kaip apskaičiuoti fermento aktyvumą

Michaelio–Menteno lygtis

Leonor Michaelis ir Maud Menten šį modelį paskelbė 1913. Jis aprašo, kaip fermento reakcijos greitis priklauso nuo substrato koncentracijos:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = reakcijos greitis, t. y. greitis esant tam tikrai substrato koncentracijai
• $V_{max}$ = didžiausiasis greitis, t. y. greitis, kai fermentas visiškai prisotintas substratu
• $[S]$ = substrato koncentracija
• $K_m$ = Michaelio konstanta: substrato koncentracija, kuriai esant greitis lygus pusei Vmax

Specifinio aktyvumo formulė

Specifinis aktyvumas gaunamas šį greitį padalijus iš esančio fermento baltymo kiekio; rezultatas išreiškiamas vienetais miligramui (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Čia $A$ yra specifinis aktyvumas, o $[E]$ – fermento koncentracija.

Vienas fermento aktyvumo vienetas (U) yra fermento kiekis, per minutę paverčiantis 1 mikromolį (µmol) substrato. Šį apibrėžimą nustatė Tarptautinė biochemijos ir molekulinės biologijos sąjunga (IUBMB).

Vienetai suderinami taip. Michaelio–Menteno lygtyje greičio vienetai yra substrato koncentracija, padalyta iš laiko. Skaičiuoklė naudoja [S] ir Km, išreikštus mM, todėl Vmax ir v išreiškiami µmol per minutę mililitre, arba µmol/(min·mL). Tai yra tas pats, kas mM/min ir U/mL. Fermento koncentracija [E] išreiškiama mg/mL. Dalijant mililitrai sutrumpėja:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax jau turi „per minutę“ dėmenį, todėl atskiro laiko nario formulėje nereikia.

Šis skaičiavimas daro prielaidą, kad išmatuotas greitis yra pradinis, nustatytas reakcijos pradžioje, prieš gerokai sumažėjant substrato koncentracijai arba produktui pradedant slopinti fermentą. Laboratorijose paprastai stebima, kol įvyksta 5–10% substrato konversija, kad būtų išlaikytas tiesinis intervalas.

Skaičiavimo pavyzdys

Pavyzdys 1. Fermento koncentracija 1 mg/mL, substrato koncentracija 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Tai pradinės skaičiuoklės reikšmės.

Greitis = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Specifinis aktyvumas = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Pavyzdys 2. Tos pačios sąlygos, tačiau fermento koncentracija padvigubinta iki 2 mg/mL.

Greitis = 33,33 µmol/(min·mL), nepakitęs, nes šiame lygtyje greitis nepriklauso nuo [E]. Specifinis aktyvumas = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Padvigubinus fermento kiekį, specifinis aktyvumas sumažėja perpus, nes tas pats bendrasis greitis dabar dalijamas iš dvigubai didesnio baltymo kiekio.

Pavyzdys 3. Substrato koncentracija padidinta iki 100 mM, gerokai viršijančio Km, o fermento koncentracija yra 1 mg/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL).

Greitis = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Specifinis aktyvumas = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Esant didelei substrato koncentracijai, fermentas beveik prisotintas, todėl greitis yra artimas Vmax.

Pavyzdys 4. Substrato koncentracija sumažinta iki 1 mM, mažesnės už Km, o fermento koncentracija yra 1 mg/mL, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL).

Greitis = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Specifinis aktyvumas = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Kai koncentracija mažesnė už Km, nedidelis substrato kiekis riboja reakciją, todėl ir greitis, ir specifinis aktyvumas yra gerokai mažesni už Vmax.

Pagrindinių parametrų paaiškinimas

Fermento koncentracija [E] – tai fermento baltymo masė tūrio vienete, išreiškiama mg/mL. Didesnė reikšmė reiškia, kad tas pats reakcijos greitis tenka didesniam baltymo kiekiui, todėl specifinis aktyvumas mažėja. Tai, ar fermento preparatas veikia gerai, parodo ne vien koncentracija, o specifinis aktyvumas.

Substrato koncentracija [S] – tai substrato kiekis, kuriuo gali veikti fermentas, paprastai išreiškiamas mM. Esant mažai [S], nedideli padidėjimai smarkiai padidina greitį. Artėjant prie prisotinimo, papildomas substratas beveik nepadeda.

Michaelio konstanta (Km) – tai substrato koncentracija, kuriai esant greitis lygus pusei Vmax. Mažas Km reiškia, kad fermentas pusę maksimalaus greičio pasiekia esant mažai substrato koncentracijai; tai rodo stiprų fermento ir substrato jungimąsi. Pavyzdžiui, gliukozei heksokinazės Km yra apie 0,1 mM, o tai rodo didelį afinitetą.

Didžiausiasis greitis (Vmax) – tai greitis, kai substrato kiekis neberiboja reakcijos. Jį įveskite µmol/(min·mL), t. y. tokiais pačiais vienetais kaip mM/min arba U/mL, kad jis atitiktų mM, naudojamus [S] ir Km. Jis priklauso nuo esančio fermento kiekio ir nuo to, kaip greitai kiekviena fermento molekulė gali paversti substratą (jos apyvartos skaičiaus, kcat).

Reakcijos trukmė – tai laikas, kurį vyko tyrimas. Ji padeda planuoti eksperimentą, nes per ilgai vykstant reakcijai gali būti išeikvotas substratas ir reakcija gali nustoti vykti tiesiškai. Tačiau pati specifinio aktyvumo formulė jos neapima.

Greičio kreivės interpretavimas

Grafike pagal Michaelio–Menteno lygtį pavaizduotas greitis priklausomai nuo substrato koncentracijos.

• Mažiau už Km: greitis didėja maždaug proporcingai substrato kiekiui. Nedidelės substrato koncentracijos paklaidos sukelia dideles rezultato paklaidas.
• Apie Km reikšmę: kreivė išlinksta. Greitis lygus pusei Vmax.
• Daugiau už Km: kreivė išsilygina. Papildomas substratas tik nedaug padidina greitį, nes fermentas beveik prisotintas.

Kodėl svarbus specifinis aktyvumas

Specifinis aktyvumas yra standartinis fermento grynumo ir kokybės rodiklis. Gryninimo metu mokslininkai jį stebi kiekviename etape: neapdorotas ląstelių ekstraktas gali rodyti kelis U/mg, o labai išgryninto mėginio reikšmė gali siekti šimtus ar tūkstančius U/mg. Didėjantis specifinis aktyvumas gryninimo proceso metu rodo, kad neaktyvus baltymas pašalinamas, o tiriamas fermentas išsaugomas.

Tas pats matavimas taikomas kuriant vaistus, kai tyrėjai tiria, kaip kandidatiniai junginiai mažina fermento aktyvumą, ir klinikinėje diagnostikoje, kai gydytojai matuoja tokių fermentų kaip ALT ir AST kiekį kraujyje, kad nustatytų kepenų pažeidimą.

Dažnai užduodami klausimai

Kaip apskaičiuoti fermento aktyvumą pagal Km ir Vmax? Pirmiausia pagal Michaelio–Menteno lygtį apskaičiuokite reakcijos greitį: v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Tada padalykite jį iš fermento koncentracijos, kad gautumėte specifinį aktyvumą U/mg: Aktyvumas = v / [E]. Vmax išreikškite µmol/(min·mL), o [E] – mg/mL, kad vienetai susiprastintų iki U/mg.

Kas yra fermento aktyvumo vienetas (U)? Vienas vienetas – tai fermento kiekis, kuris nustatytomis sąlygomis per minutę paverčia 1 µmol substrato, kaip apibrėžė IUBMB.

Kodėl formulėje nėra reakcijos trukmės? Vmax jau išreiškiamas kiekiu per minutę, todėl tai yra greitis, o ne bendras kiekis. Dar kartą dalijant iš laiko, jis būtų įskaičiuotas du kartus, o rezultatas priklausytų nuo tyrimo trukmės. Fermento savybė nuo tyrimo trukmės priklausyti neturėtų.

Kodėl didėjant fermento koncentracijai specifinis aktyvumas mažėja? Michaelio–Menteno lygtyje greitis nepriklauso nuo fermento koncentracijos. Specifinis aktyvumas gaunamas šį nekintantį greitį padalijus iš [E], todėl didesnė [E] reikšmė duoda mažesnį rezultatą. Teisingai lyginant skirtingos koncentracijos fermentų preparatus, lyginamas ne grynasis greitis, o specifinis aktyvumas.

Ką reiškia maža Km reikšmė? Maža Km reikšmė reiškia, kad fermentas pusę didžiausiojo greičio pasiekia esant mažai substrato koncentracijai, o tai rodo stiprų fermento ir substrato jungimąsi.

Ar specifinis aktyvumas gali būti neigiamas? Ne. Neigiamas rezultatas rodo įvesties klaidą, pavyzdžiui, neigiamą koncentraciją, arba skaičiavimo klaidą, o ne tikrą fermento matavimo rezultatą.

Šaltiniai

1. Michaelis, L., ir Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L. ir Stryer, L. (2012). Biochemistry (7 leid.). W.H. Freeman and Company.
3. Tarptautinė biochemijos ir molekulinės biologijos sąjunga (IUBMB). Fermentų nomenklatūra. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. BRENDA fermentų duomenų bazė. https://www.brenda-enzymes.org/