Baltymų Tirpumo Skaičiuoklė - Nemokamas pH ir Temperatūros Įrankis

Baltymų tirpumo skaičiuotuvas įvertina didžiausią baltymo koncentraciją, kuri išlieka ištirpusi tirpiklyje esant tam tikram pH, temperatūrai ir joniniam stipriui. Jis pagrindinius chemijos principus paverčia vienu skaičiumi – baltymo miligramais viename tirpiklio mililitre.

Baltymų tirpumas yra svarbus biochemijoje, vaistų formavime ir maisto moksle. Baltymas, kuris neišlieka ištirpęs, sudaro agregatus arba nuosėdas, todėl gali sugadinti eksperimentą arba padaryti vaistą netinkamą suleisti.

Kaip apskaičiuoti baltymų tirpumą

Tirpumas priklauso nuo penkių dalykų: baltymo izoelektrinio taško (pH, kuriam esant jo grynasis krūvis lygus nuliui), lydymosi temperatūros (temperatūros, kuriai esant jis pradeda išsiskleisti), tirpiklio dielektrinės skvarbos (rodiklio, parodančio, kaip gerai jis atskiria įkrautas daleles), tirpalo pH ir joninio stiprio (rodiklio, parodančio, kiek ištirpusios druskos yra tirpale).

Skaičiuotuvas pradeda nuo žinomo kiekvieno baltymo tirpumo vandenyje esant nustatytoms etaloninėms sąlygoms: 25 °C, pH 7,0 ir joniniam stipriui 0,15 M (maždaug tokiam druskos kiekiui, koks yra kraujyje). Tada šią etaloninę reikšmę padaugina iš keturių santykių – po vieną kiekvienai pasikeitusiai sąlygai.

Baltymų tirpumo formulė

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ – žinomas baltymo tirpumas vandenyje esant etaloninėms sąlygoms, išreikštas mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, kur $pI$ yra baltymo izoelektrinis taškas. Tirpumas mažiausias izoelektriniame taške ir didėja pH tolstant nuo jo, o po kelių pH vienetų pokytis išsilygina.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, kur $I$ yra joninis stipris moliais litre. Esant mažai druskos koncentracijai, šis veiksnys šiek tiek padidina tirpumą (vadinamasis įsūdymas). Esant didelei druskos koncentracijai, jis tirpumą sumažina (vadinamasis išsūdymas).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, kur $T_m$ yra baltymo lydymosi temperatūra °C. Tirpumas kylant temperatūrai pamažu didėja, o temperatūrai priartėjus prie $T_m$ ir baltymui pradėjus išsivynioti, staigiai mažėja.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, kur $\varepsilon$ yra tirpiklio dielektrinė skvarba. Vandens dielektrinė skvarba yra 78,4, todėl vandenyje šis narys lygus 1. Tirpikliai, kurie krūvius atskiria ne taip veiksmingai kaip vanduo, pavyzdžiui, etanolis, tirpumą mažina.

Skaičiuotuvo naudojamos etaloninės reikšmės

Tirpumo kategorijos

Pavyzdys: albuminas fosfatiniame buferyje

Nustatykite albumino tirpumą fosfatiniame buferyje esant 25 °C, pH 7,4 ir joniniam stipriui 0,15 M.

Albumino etaloninės reikšmės yra $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml ir $T_m = 63°C$. Fosfatinio buferio dielektrinė skvarba yra 76,0.

1. pH narys: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Santykis: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Joninis narys: joninis stipris (0,15 M) lygus etaloninei reikšmei, todėl santykis yra 1.
3. Temperatūros narys: temperatūra (25 °C) lygi etaloninei reikšmei, todėl santykis yra 1.
4. Tirpiklio narys: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/ml}$

Skaičiuotuvas pateikia rezultatą 492,12 mg/ml, kuris priskiriamas kategorijai „labai tirpus“.

Pavyzdys: lizocimas glicerolyje esant žemai temperatūrai

Nustatykite lizocimo tirpumą glicerolio tirpale esant 4 °C, pH 5,0 ir joniniam stipriui 0,1 M. Šios sąlygos panašios į fermento laikymą šaltai.

Lizocimo etaloninės reikšmės yra $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/ml ir $T_m = 72°C$. Glicerolio dielektrinė skvarba yra 42,5.

1. pH narys: pH pakeitus iš 7,0 į 5,0 (abu dydžiai gerokai mažesni už pI 11,35), pH narys pasikeičia tik nežymiai. Santykis: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Joninis narys: sumažinus joninį stiprį nuo 0,15 M iki 0,1 M, dėl įsūdymo poveikio tirpumas šiek tiek padidėja. Santykis: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperatūros narys: atvėsinus nuo 25 °C iki 4 °C, gerokai žemiau lydymosi temperatūros, šis narys sumažėja. Santykis: 0,8106.
4. Tirpiklio narys: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/ml}$

Skaičiuotuvas pateikia rezultatą 35,88 mg/ml, kuris priskiriamas kategorijai „tirpus“. Rezultatą nuo etaloninės reikšmės sumažina ne žema temperatūra, o maža glicerolio dielektrinė skvarba.

Kaip naudoti baltymų tirpumo skaičiuotuvą

1. Pasirinkite baltymą iš sąrašo: albuminą, insuliną, lizocimą, hemoglobiną, mioglobiną, kolageną, kazeiną arba fibrinogeną.
2. Pasirinkite tirpiklį: vandenį, fosfatinį buferį, Tris buferį, glicerolį, DMSO, metanolį, etanolį arba acetoną.
3. Įveskite temperatūrą °C (nuo 0 iki 100), pH (nuo 0 iki 14) ir molinį joninį stiprį (nuo 0 iki 2).
4. Perskaitykite apskaičiuotą tirpumą mg/ml ir jo kategoriją. Po rezultatu esanti juosta rodo reikšmę skalėje nuo 0 iki 100 mg/ml ir visiškai užsipildo ties 100 mg/ml arba didesne reikšme.

Kas turi įtakos baltymų tirpumui

pH ir izoelektrinis taškas. Kiekvienas baltymas turi izoelektrinį tašką – pH, kuriam esant jo paviršius neturi grynojo elektrinio krūvio. Esant šiam pH, baltymų molekulės viena kitos neatstumia, todėl susitelkia ir lengviau iškrinta iš tirpalo. Nukrypus pH nuo izoelektrinio taško bet kuria kryptimi, baltymas įgauna grynąjį krūvį. Įkrautos molekulės viena kitą atstumia, todėl lieka atskiros ir ištirpusios.

Joninis stipris. Ištirpę druskos jonai apsupa įkrautas baltymo paviršiaus grupes. Esant mažai arba vidutinei koncentracijai, šie jonai ekranuoja krūvius, kurie kitu atveju trauktų dvi baltymo molekules vieną prie kitos, todėl tirpumas padidėja. Šis procesas vadinamas įsūdymu. Esant didelei druskos koncentracijai, jonai konkuruoja su baltymu dėl vandens molekulių ir pašalina vandens sluoksnį, padedantį baltymui išlikti ištirpusiam. Šis procesas vadinamas išsūdymu ir yra įprasto gryninimo metodo, kai baltymai iš mišinio nusodinami amonio sulfatu, pagrindas.

Temperatūra. Tirpalo šildymas paprastai didina tirpumą iki tam tikros ribos. Temperatūrai priartėjus prie baltymo lydymosi temperatūros, baltymas pradeda išsiskleisti. Baltymui išsiskleidus, atsiveria hidrofobinės (vandenį atstumiančios) baltymo dalys, kurios įprastai būna paslėptos jo susilanksčiusioje struktūroje. Šios atsivėrusios dalys sulimpa tarpusavyje, todėl susidaro agregatai, o tirpumas ties lydymosi temperatūra ir aukštesnėje temperatūroje staigiai sumažėja.

Tirpiklis. Tirpiklio dielektrinė skvarba parodo, kaip veiksmingai jis susilpnina elektrinę trauką tarp įkrautų dalelių. Vandens dielektrinė skvarba yra didelė, todėl jis gerai atskiria krūvius; dėl to dauguma baltymų vandenyje tirpsta geriau nei organiniuose tirpikliuose, pavyzdžiui, etanolyje ar acetone. Mažos dielektrinės skvarbos tirpikliai leidžia skirtingų baltymų molekulių priešingiems krūviams traukti vieniems kitus stipriau, todėl skatina agregaciją.

Apribojimai

Skaičiuotuvas naudoja supaprastintą modelį, pagrįstą nedideliu etaloninių baltymų ir standartinių tirpiklių rinkiniu. Jame neatsižvelgiama į baltymo grynumą, priedus, pavyzdžiui, detergentus ar stabilizatorius, ir neįprastus buferio komponentus. Rezultatai yra eksperimentų planavimo įverčiai, o ne tiesioginio tirpumo matavimo laboratorijoje pakaitalas.

Dažnai užduodami klausimai

Kas yra baltymų tirpumas? Baltymų tirpumas yra didžiausia baltymo koncentracija, kuri išlieka visiškai ištirpusi tirpiklyje nesudarant matomų agregatų ar nuosėdų.

Kodėl baltymas mažiausiai tirpus izoelektriniame taške? Izoelektriniame taške baltymas neturi grynojo elektrinio krūvio, todėl baltymų molekulės nebesistumia elektra. Nesant šio atstūmimo, jos lengviau sulimpa ir iškrinta iš tirpalo.

Kuo skiriasi įsūdymas ir išsūdymas? Įsūdymas vyksta esant nedidelei druskos koncentracijai: ištirpę jonai ekranuoja baltymo įkrautas grupes vieną nuo kitos ir padidina tirpumą. Išsūdymas vyksta esant didelei druskos koncentracijai: jonai pašalina vandenį nuo baltymo paviršiaus ir sumažina tirpumą.

Ar aukštesnė temperatūra visada didina tirpumą? Ne. Tirpumas kylant temperatūrai paprastai didėja tik iki tam tikros ribos. Temperatūrai priartėjus prie baltymo lydymosi temperatūros, baltymas pradeda išsivynioti, dėl to baltymai dažniausiai agreguojasi, o tirpumas smarkiai sumažėja.

Kodėl baltymai etanolyje ar acetone tirpsta prasčiau nei vandenyje? Vandens dielektrinė skvarba yra didelė, todėl jis labai veiksmingai susilpnina elektrinę trauką tarp įkrautų baltymų molekulių dalių. Etanolio ir acetono dielektrinė skvarba mažesnė, todėl šiuose tirpikliuose skirtingų baltymų molekulių įkrautos grupės traukia viena kitą stipriau ir agregacija tampa labiau tikėtina.

Kiek tikslus šis skaičiuotuvas? Jis pateikia įvertį, pagrįstą fizikiniu modeliu ir nedideliu etaloninių baltymų bei tirpiklių rinkiniu. Jis padeda susiaurinti sąlygų, kurias verta išbandyti, pasirinkimą, tačiau tik eksperimentinis matavimas gali patvirtinti konkretaus baltymo mėginio tirpumą.

Papildoma literatūra

• Arakawa, T. ir Timasheff, S. N. (1984). Baltymų įsūdymo ir išsūdymo dvivalenčių katijonų druskomis mechanizmas. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M. ir Pace, C. N. (2008). Baltymų tirpumo matavimas ir didinimas. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J. ir Edsall, J. T. (1943). Baltymai, aminorūgštys ir peptidai kaip jonai ir dipoliniai jonai. Reinhold Publishing.