Pereiti prie turinio
🛠️
Whiz Tools

BCA mėginio tūrio skaičiuoklė | Baltymų kiekybinio įvertinimo įrankis

Akimirksniu apskaičiuokite mėginių tūrius pagal BCA absorbcijos rodmenis. Gaukite tikslų baltymų užkrovimo tūrį vakarų blotams, fermentų tyrimams ir imunoprecipitacijos eksperimentams.

BCA absorbcijos mėginio tūrio skaičiuoklė

Apskaičiuokite tikslų mėginio tūrį iš BCA absorbcijos rodmenų ir tikslinės baltymų masės. Įveskite absorbcijos vertes ir pageidaujamus baltymų kiekius, kad gautumėte tikslų tūrį nuosekliam užkrovimui.

Standartinės kreivės konfigūracija

Standartinės kreivės tipas
BCA standartinė kreivė
BCA standartinės kreivės vizualizacija0.0000.5001.0001.5002.0002.500Baltymų koncentracija (μg/μL)00.511.522.5Absorbancija (A562)

Mėginių įvestys

Mėginys 1

Mėginio tūris
—μL

Rezultatų santrauka

Mėginio pavadinimasAbsorbcijaMėginio masė (μg)Baltymų koncentracija (μg/μL)Mėginio tūris (μL)
Mėginys 1————

Skaičiavimo formulė

Mėginio tūris apskaičiuojamas naudojant šią formulę:

Mėginio tūris (μL) = Mėginio masė (μg) / Baltymų koncentracija (μg/μL)
Naudojimo patarimai

• Laikykite absorbciją tarp 0,1-2,0 tikslių rezultatų linijinėje srityje

• Tipiniai kiekiai: 20-50 μg vakarų blotams, 500-1000 μg imunoprecipitacijai

• Tūriai virš 1000 μL rodo žemą baltymų koncentraciją - apsvarstykite mėginio sukoncentravimą

• Standartinis BCA tinka daugumai taikymų (20-2000 μg/mL). Naudokite patobulintą skiestiems mėginiams (5-250 μg/mL)

Įkrovimo skaičiuotuvas...
📚

Dokumentacija

Greitas BCA mėginio tūrio skaičiuotuvas baltymų kiekybiniam įvertinimui

Kai tik baigiate atlikti BCA tyrimą ir reikia apskaičiuoti, kiek mėginio užpildyti western blot, susiduriate su skaičiavimu, kuris principu yra paprastas, bet praktikoje varginantis. Išmatuokite absorbciją 562 nm bangos ilgiu, palyginkite su standartine kreive, apskaičiuokite baltymų koncentraciją, tada nustatykite reikalingą tūrį pageidaujamam baltymų kiekiui.

Šis skaičiuotuvas akimirksniu atlieka šiuos skaičiavimus. Įveskite savo BCA absorbcijos rodmenį ir tikslinį baltymų kiekį - gausite tikslų mėginio tūrį mikrolitrais. BCA tyrimai yra ypač patikimi dėl jų atsparumo detergentas ir paviršiaus aktyvioms medžiagoms, kurios trukdytų Bradford ar Lowry metodams. Dirbant su ląstelių lizatais, kuriuose yra SDS ar Triton X-100, BCA išlieka tikslus, kai kiti metodai nepavyksta.

Kaip veikia BCA baltymų kiekybinis nustatymas

BCA tyrimo principas

BCA (bicinchoninic rūgšties) tyrimai veikia per dviejų žingsnių vario reakciją. Baltymai redukuoja Cu²⁺ į Cu¹⁺ šarminėmis sąlygomis — redukcijos kiekis tiesiogiai koreliuoja su baltymų koncentracija. Štai kur įeina bicinchoninic rūgštis: ji jungiasi su Cu¹⁺, suformuodama intensyviai violetinį kompleksą, kuris sugeria šviesą 562 nm bangos ilgyje.

Šią violetinę spalvą matuojate spektrofotometru. Kuo tamsesnė violetinė, tuo daugiau baltymų. Palyginkite savo mėginio absorbciją su standartine kreive (paprastai naudojant BSA standartus), ir jūs turite savo baltymų koncentraciją. BCA privalumas yra tas, kad jis veikia patikimai net esant detergentuose, redukuojantiems cukrums ar kitiems įprastiems buferių komponentams — medžiagoms, kurios sutrukdytų Bradford ar Lowry tyrimus.

Formulė mėginio tūrio apskaičiavimui

Pagrindinė formulė mėginio tūriui apskaičiuoti iš BCA absorbcijos rezultatų yra:

Me˙ginio Tuˉris (μL)=Me˙ginio Mase˙ (μg)Baltymų Koncentracija (μg/μL)\text{Mėginio Tūris (μL)} = \frac{\text{Mėginio Masė (μg)}}{\text{Baltymų Koncentracija (μg/μL)}}

Kur:

  • Mėginio Tūris yra reikalingas mėginio tūris (mikrolitrais, μL)
  • Mėginio Masė yra norimas naudoti baltymų kiekis (mikrogramais, μg)
  • Baltymų Koncentracija yra išvedama iš BCA absorbcijos skaitymo (μg/μL)

Baltymų koncentracija apskaičiuojama iš absorbcijos skaitymo naudojant standartinės kreivės lygtį:

Baltymų Koncentracija (μg/μL)=Nuolydis×Absorbcija+Intercept\text{Baltymų Koncentracija (μg/μL)} = \text{Nuolydis} \times \text{Absorbcija} + \text{Intercept}

Standartiniam BCA tyrimui, tipiškas nuolydis yra apytikriai 2.0, o intercept dažnai yra arti nulio, nors šios reikšmės gali skirtis priklausomai nuo jūsų specifinių tyrimo sąlygų ir standartinės kreivės. Pagal Enzimologijos metodų protokolus, standartinės kreivės generavimas su bent 5-6 taškais, apimančiais jūsų numatomą koncentracijos intervalą, užtikrina tikslų kiekybinį nustatymą įvairiems baltymų tipams.

BCA mėginio tūrio skaičiuoklės naudojimas

Skaičiuoklė supaprastina tai, kas kitu atveju reikalautų rankinio skaičiavimo kiekvienam mėginiui:

  1. Įveskite savo matavimus:

    • Pažymėkite savo mėginį (naudinga apskaičiuojant tūrius keliems mėginiams vienu metu)
    • Įveskite absorbcijos rodmenį iš spektrofotometro 562 nm bangos ilgyje
    • Nurodykite, kiek proteino jums reikia mikrogramais (paprastai 10-50 μg vakarų blotams, 500-1000 μg imunoprecipitacijai)

  2. Pasirinkite standartinės kreivės tipą:

    • Standartinis BCA: Dažniausiai naudojamas protokolas, veikia 20-2000 μg/mL intervale
    • Patobulintas BCA: Didesnis jautrumas skiestiems mėginiams (5-250 μg/mL)
    • Mikro BCA: Mikroplokštelės formatas, kai mėginio tūris ribotas
    • Pasirinktinis: Įveskite savo nuožiūra nustatytą nuolydį ir interceptą, jei sugeneravote kitokią standartinę kreivę

  3. Gaukite savo mėginio tūrį:

    • Skaičiuoklė iš karto parodo, kiek mikrolitrų jums reikia pipetės
    • Pridėkite kelis mėginius, kad apskaičiuotumėte visą plokštelę vienu kartu
    • Nukopijuokite rezultatus tiesiai į savo laboratorijos užrašų knygutę arba LIMS

Realaus pasaulio pavyzdys

Tarkime, ruošiate mėginius vakarų blotui, lyginant baltymų raišką šešiose ląstelių linijose. Atlikę BCA tyrimą, vienas mėginys rodo 0,75 absorbcijos rodmenį. Jums reikia 20 μg proteino vienai linijai.

Naudojant standartinę kreivę (nuolydis = 2,0, intercepas = 0):

  • Proteino koncentracija = 2,0 × 0,75 + 0 = 1,5 μg/μL
  • Reikalingas mėginio tūris = 20 μg ÷ 1,5 μg/μL = 13,33 μL

Pipetės 13,33 μL šio mėginio, pridėsite krūvio buferį, ir turėsite lygiai 20 μg proteino. Tuo tarpu mėginys su 1,2 absorbcijos rodmeniu reikalaus tik 8,33 μL tam pačiam 20 μg kiekiui. Skaičiuoklė panaikina poreikį skaičiuoti kiekvieną mėginį rankiniu būdu - tiesiog įveskite savo rodmenis ir iš karto gaukite visus tūrius.

Rezultatų supratimas

Skaičiuotuvas pateikia keletą svarbių informacijos dalių:

  1. Baltymų koncentracija: Apskaičiuojama iš jūsų absorbcijos rodmens naudojant pasirinktą standartinę kreivę. Ji rodo baltymų kiekį tūrio vienete jūsų mėginyje (μg/μL).

  2. Mėginio tūris: Tai mėginio tūris, kuriame yra pageidaujamas baltymų kiekis. Šią vertę naudosite ruošdami eksperimentus.

  3. Įspėjimai ir rekomendacijos: Skaičiuotuvas gali pateikti įspėjimus dėl:

    • Labai aukštų absorbcijos rodmenų (>3,0), kurie gali būti už tyrimo tiesinio diapazono ribų
    • Labai žemų absorbcijos rodmenų (<0,1), kurie gali būti arti aptikimo ribos
    • Apskaičiuotų tūrių, kurie yra praktiškai per dideli (>1000 μL) arba per maži (<1 μL)

Praktinės Laboratorinės Taikymo Sritys

Vakarų Bloto Mėginio Paruošimas

Nesuderintas baltymų užkrovimas yra viena dažniausių priežasčių, kodėl vakarų blotai nepateikia patikimų rezultatų. Galite matyti stiprias juostas vienoje linijoje ir silpnas kitoje - ne todėl, kad skiriasi raiškos lygiai, bet todėl, kad užkrovėte skirtingus bendro baltymo kiekius.

Sprendimas yra paprastas, bet reikalauja tikslių tūrio skaičiavimų. Kai turite BCA absorbcijos rodmenis visiems mėginiams, nustatykite, kiek baltymo užkrauti į kiekvieną liniją (paprastai naudoju 20-30 μg gaubiems baltymams, iki 50 μg mažiau gaubiems tiksliniams baltymams). Apskaičiuokite reikiamą tūrį kiekvienam mėginiui, tada normalizuokite suvedant visus mėginius į vienodą galutinį tūrį su lizės buferiu prieš pridedant Laemmli buferį.

Dažna klaida: pamiršti, kad mėginio tūris pasikeičia pridėjus užkrovimo buferį. Jei krauna 15 μL bendro tūrio ir užkrovimo buferis yra 4x, jums reikia 3,75 μL buferio ir 11,25 μL mėginio skiedimo. Planuokite skiedimus atitinkamai.

Fermentiniai Tyrimai

Fermentų kinetikos matavimai reikalauja nuoseklių baltymų kiekių tarp pakartojimų ir sąlygų. Lyginant fermentų aktyvumą tarp skirtingų ląstelių apdorojimų ar audinių mėginių, turite žinoti, kad pradedate nuo to paties bendro baltymo kiekio - priešingu atveju aktyvumo skirtumai gali tiesiog atspindėti fermentų koncentracijos skirtumus.

Fermentų tyrimuose paprastai dirbu su mažesniais baltymų kiekiais nei vakarų blotuose - dažnai 5-10 μg reakcijai gaubiems fermentams. Raktas - išlaikyti šį nuoseklumą visose sąlygose ir laiko taškuose.

Imunopreipitacijos Eksperimentai

IP eksperimentai gali sunaudoti žymius baltymų kiekius - paprastai 500-1000 μg bendro lizato reakcijai. Kai traukiate mažai gausų baltymą ar bandote kelis antikūnius, galite apdoroti daugiau nei tuzinas IP viename eksperimente.

Pradėjus su nevienodomis baltymų kiekiais, sugadinamas visas eksperimentas. Jei vienas mėginys turi 800 μg įvesties, o kitas - 1200 μg, negalėsite prasmingai palyginti ko-nusodintu baltymų kiekio. Apskaičiuokite reikiamą tūrį kiekvienam lizatui, normalizuokite iki vienodo bendro tūrio su lizės buferiu, tada tęskite antikūnų inkubaciją. Tai užtikrina, kad bet kokie matomi skirtumai vakarų blote atspindi tikrus biologinius skirtumus, o ne pradinės medžiagos variacijas.

Baltymų Gryninimas

Baltymų koncentracijos sekimas per gryninimo etapus yra esminis apskaičiuojant išeigą ir nustatant, kuriose frakcijose yra jūsų tiksliniai baltymai. Paprastai vykdote BCA tyrimus kolonėlės frakcijose, kad nustatytumėte viršūnės frakcijas ir įvertintumėte gryninimo efektyvumą.

Kas čia naudinga: apskaičiuokite bendrą baltymų kiekį kiekvienoje frakcijoje (koncentracija × tūris), kad sektumėte atkūrimą per gryninimo schemą. Jei pradedate su 500 mg bendro baltymo lizate ir baigate su 2 mg gryno baltymo 95% grynumu, atkūrėte 0,4% bendro baltymo, bet žymiai praturtinote savo taikinį. Šie skaičiavimai padeda optimizuoti gryninimo protokolą.

Išplėstinės funkcijos ir svarstymai

Pasirinktinės standartinės kreivės

Nors skaičiuotuvas pateikia numatytuosius parametrus standartiniams BCA tyrimams, jūs taip pat galite įvesti pasirinktinius vertes, jei sukūrėte savo standartinę kreivę. Tai ypač naudinga, kai:

  • Dirbate su nestandartinėmis baltymų pavyzdžiais
  • Naudojate modifikuotus BCA protokolus
  • Dirbate esant medžiagoms, kurios gali trukdyti tyrimui

Norėdami naudoti pasirinktinę standartinę kreivę:

  1. Pasirinkite "Pasirinktinis" iš standartinės kreivės parinkčių
  2. Įveskite savo nuolydžio ir intercepso vertes
  3. Skaičiuotuvas naudos šias vertes visiems tolesniems skaičiavimams

Kelių pavyzdžių tvarkymas

Skaičiuotuvas leidžia pridėti kelis pavyzdžius ir vienu metu apskaičiuoti jų tūrius. Tai ypač naudinga ruošiant pavyzdžius eksperimentams, kuriems reikia nuoseklaus baltymų užkrovimo skirtingomis sąlygomis.

Grupinio apdorojimo privalumai:

  • Sutaupyti laiko apskaičiuojant visus tūrius iš karto
  • Užtikrinti nuoseklumą visuose pavyzdžiuose
  • Lengvai palyginti baltymų koncentracijas tarp pavyzdžių
  • Nustatyti išskirtinius ar galimus matavimo klaidų atvejus

Dažniausių problemų šalinimas

Absorbcija virš tiesinio diapazono

Absorbcijos rodmenys virš 2,0 paprastai patenka už daugumos BCA standartinių kreivių tiesinio diapazono ribų. Tai pastebėsite labai koncentruotuose pavyzdžiuose — grynintuose baltymuose, branduolinėse ištraukose ar netinkamai praskiestuose lizatuose.

Sprendimas paprastas: praskieskite savo pavyzdį 1:5 arba 1:10 vandenyje ar lizės buferyje, pakartokite BCA tyrimą ir padauginkite apskaičiuotą koncentraciją iš skiedimo faktoriaus. Nebandykite ekstrapoliuoti už savo standartinės kreivės tiesinio diapazono — ryšys tarp absorbcijos ir koncentracijos sutrinka esant didelėms koncentracijoms, kas lemia per mažai įvertintas baltymų vertes.

Žema absorbcija arti aptikimo ribų

Kai absorbcija nukrenta žemiau 0,1, matavimo tikslumas tampa problematiškas. Jūs esate arti apatinės aptikimo ribos, kur maži absorbcijos skirtumai verčia didelius skaičiuojamos koncentracijos skirtumus.

Skiestiems pavyzdžiams apsvarstykite perjungimą į pagerintus ar mikro BCA protokolus, kurie siūlo geresnį jautrumą. Alternatyviai, sukoncentruokite savo pavyzdį naudodami centrifuginius filtrus (Amicon ar panašius). Kraštutiniais atvejais koreguokite eksperimento dizainą, kad dirbtumėte su mažiau baltymų — daugelis taikymų toleruoja mažesnius užkrovimo kiekius, nei galėtumėte tikėtis.

Tūrio skaičiavimai, kurie nesuprantami

Skaičiuotuvas gali pasakyti, kad reikia pipetės 150 μL, kai jūsų didžiausias šulinio talpumas yra 30 μL. Arba siūlo 0,8 μL, kas yra žemiau tikslaus pipetavimo diapazono daugumai mikropipiečių.

Dideliems tūriams: sukoncentruokite savo pavyzdį naudodami centrifuginius filtrus ar nusodinimo metodus (TCA ar acetono nusodinimas). Mažiems tūriams: arba praskieskite savo pavyzdį (tada naudokite proporcingai daugiau tūrio), arba sumažinkite tikslinį baltymų kiekį, jei jūsų eksperimentas tai leidžia.

Baltymų kiekybinės analizės metodų evoliucija

Baltymų kiekybinė analizė nuėjo ilgą kelią nuo Kjeldahl metodo 1883 metais, kai reikėjo mėginius virti sieros rūgštyje, siekiant išmatuoti azoto kiekį. Laboratorijoms reikėjo specializuotos įrangos ir didelės ekspertizės net paprasčiausiam baltymų koncentracijos įvertinimui.

Kaip Atsirado Šiuolaikiniai BCA Tyrimai

Biuret testas (ankstyvieji 1900-ieji) atnešė spalvometrinę analizę į baltymų kiekybinę analizę. Peptidų ryšiai jungiasi su vario jonais šarminėje aplinkoje, sukurdami violetinę spalvą. Paprastas, bet ne itin jautrus.

Oliveris Lowry 1951 metais patobulino šį metodą, sujungdamas Biuret reakciją su Folin-Ciocalteu reagentu. Lowry tyrimas viešpatavo baltymų kiekybinėje analizėje dešimtmečiais, tačiau turėjo kritinį trūkumą: daugelis įprastų laboratorinių cheminių medžiagų trikdė reakciją - detergentas, EDTA, net aukšta druskų koncentracija galėjo iškreipti matavimus.

Mariono Bradfordo 1976 metų metodas, naudojantis Coomassie Brilliant Blue G-250, siūlė greitį - rezultatai per 5 minutes vietoj 30 - tačiau turėjo savų problemų. Dažiklis selektyviai jungiasi prie bazinių aminorūgščių, todėl baltymų sudėtis dramatiškai veikia matavimus. Dar kritiškiau, detergentas, naudojamas ląstelių lizavimui, visiškai sutrikdo tyrimą.

1985 metais atsirado BCA tyrimas. Polas Smitas ir kolegos iš Pierce Chemical Company atpažino, kad bicinchonininė rūgštis gali jautriau aptikti Cu¹⁺ jonus nei tradiciniai biuret reagentai. Jų inovacija sujungė biuret chemijos toleranciją įvairiems buferiniams komponentams su pagerintu jautrumu, sukurdama metodą, kuris patikimai veikia net esant detergentuose, redukuojantiems cukrums ir kitoms medžiagoms, kurios trikdo Bradford ar Lowry tyrimus. Būtent dėl šios priežasties BCA tapo standartiniu metodu baltymams kiekybiškai įvertinti iš ląstelių lizatų - jis veikia realiomis mėginių sąlygomis.

Pavyzdžiai kaip apskaičiuoti mėginio tūrį

Excel formulė

1=IF(B2<=0,"Klaida: Netinkamas absorbcijos rodiklis",IF(C2<=0,"Klaida: Netinkama mėginio masė",C2/(2*B2)))
2
3' Kur:
4' B2 yra absorbcijos rodiklis
5' C2 yra norima mėginio masė μg
6' Formulė grąžina reikalingą mėginio tūrį μL
7

Python realizacija

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """Apskaičiuoti baltymų koncentraciją pagal absorbciją naudojant standartinę kreivę."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("Absorbcija negali būti neigiama")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """Apskaičiuoti reikalingą mėginio tūrį pagal absorbciją ir norimą masę."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("Mėginio masė turi būti teigiama")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# Naudojimo pavyzdys
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"Esant absorbcijai {absorbance} ir norimai baltymų masei {sample_mass} μg:")
31    print(f"Baltymų koncentracija: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"Reikalingas mėginio tūris: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"Klaida: {e}")
35

R kodas analizei

1# Funkcija baltymų koncentracijos apskaičiavimui pagal absorbciją
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("Absorbcija negali būti neigiama")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcija mėginio tūrio apskaičiavimui
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("Mėginio masė turi būti teigiama")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Naudojimo pavyzdys
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("Esant absorbcijai %.2f ir norimai baltymų masei %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("Baltymų koncentracija: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("Reikalingas mėginio tūris: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("Klaida: %s\n", e$message))
39})
40

JavaScript realizacija

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("Absorbcija negali būti neigiama");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("Mėginio masė turi būti teigiama");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Naudojimo pavyzdys
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`Esant absorbcijai ${absorbance} ir norimai baltymų masei ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`Baltymų koncentracija: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`Reikalingas mėginio tūris: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`Klaida: ${error.message}`);
37}
38

Standartinės kreivės vizualizacija

Ryšys tarp absorbcijos ir baltymų koncentracijos paprastai yra tiesinis tam tikrame intervale. Žemiau pateikta standartinė BCA kreivė:

BCA standartinė kreivė baltymų kiekybiniam įvertinimui Absorbcijos ir baltymų koncentracijos tiesinio ryšio vizualizacija BCA tyrimo metu 0,0 
<text x="150" y="370">0,5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1,0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1,5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2,0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2,5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
0,0 
<text x="45" y="300">1,0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2,0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3,0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4,0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5,0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6,0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

Absorbcija (562 nm) Baltymų koncentracija (μg/μL)

Standartinė kreivė Standartiniai mėginiai

BCA standartinė kreivė

Palyginimas su Kitais Baltymų Kiekybinio Nustatymo Metodais

Skirtingi baltymų kiekybinio nustatymo metodai turi įvairių privalumų ir apribojimų. Štai kaip BCA tyrimas lyginamas su kitais įprastais metodais:

MetodasJautrumo IntervalasPrivalumaiApribojimaiTinka Labiausiai
BCA Tyrimas5-2000 μg/mL• Suderinamas su detergentas
• Mažesnė baltymų tarpusavio variacija
• Stabilus spalvos išsivystymas		• Trukdomi redukuojantys agentai
• Veikiami kai kurių chelatorių		• Bendras baltymų kiekybinis nustatymas
• Mėginiai su detergentas
Bredfordo Tyrimas1-1500 μg/mL• Greitas (2-5 min)
• Mažai trukdančių medžiagų		• Didelė baltymų tarpusavio variacija
• Nesuderinamas su detergentas		• Greiti matavimai
• Mėginiai be detergentas
Lourio Metodas1-1500 μg/mL• Gerai nustatytas
• Geras jautrumas		• Daug trukdančių medžiagų
• Daug etapų		• Istorinis nuoseklumas
• Gryni baltymų mėginiai
UV Absorbcija (280 nm)20-3000 μg/mL• Neardantis
• Labai greitas
• Nereikia reagentų		• Veikiamas nukleininių rūgščių
• Reikalauja grynų mėginių		• Gryni baltymų tirpalai
• Greitos patikros valymo metu
Fluorometrinis0,1-500 μg/mL• Aukščiausias jautrumas
• Platus dinaminis intervalas		• Brangūs reagentai
• Reikalauja fluorometro		• Labai skiesti mėginiai
• Ribotas mėginio tūris

Dažniausiai užduodami klausimai

Kam naudojamas BCA tyrimas?

BCA tyrimai kiekybiškai nustato bendrą baltymų koncentraciją jūsų mėginiuose. Jūs jį naudosite, kai reikia žinoti, kiek turite baltymų - prieš atliekant Vakarų blotą, kad užtikrintumėte vienodą užkrovimą, prieš fermentų tyrimus normalizuojant aktyvumo matavimus, baltymų gryninimo metu sekant išeigą arba ruošiant mėginius masių spektometrijai. Jis tapo numatytuoju baltymų kiekybinio nustatymo metodu daugelyje molekulinės biologijos ir biochemijos laboratorijų, nes gerai tvarko detergentuose ir buferiniuose komponentuose esančius baltymus.

Koks tikslus yra BCA tyrimas?

Geromis sąlygomis tikėkitės 5-10% tikslumo. Tai priklauso nuo tinkamos standartinės kreivės sudarymo (bent 5-6 taškai, apimantys jūsų numatomą koncentracijos intervalą), naudojant šviežius reagentus ir užtikrinant, kad mėginiuose nebūtų didelės koncentracijos trukdančių medžiagų. Baltymų sudėtis turi reikšmės - kolagenas ir želatina duoda neįprastai aukštus rodiklius dėl jų aminorūgščių sudėties, o histonai - žemesnius. Daugumai taikymų 5-10% paklaida yra priimtina ir daug geresnė nei mėginių užkrovimas be jokio kiekybinio nustatymo.

Kas gali trukdyti BCA tyrimo rezultatams?

Redukuojančios medžiagos yra didžiausia problema - DTT, β-merkaptoetanolis ir glutationas visi redukuoja Cu²⁺ į Cu¹⁺ nepriklausomai nuo baltymų, dirbtinai didinant jūsų rodiklius. Jei jūsų lizės buferį sudaro redukuojančios medžiagos, praskieskite mėginius bent 1:10, kad sumažintumėte trukdžius. Chelatoriai (EDTA, EGTA) veikia priešinga kryptimi, sudarydami kompleksus su vario jonais, mažindami spalvos susidarymą. Aukštos paprastų cukrų, lipidų ir amoniako junginių koncentracijos taip pat gali trukdyti. Thermo Fisher BCA baltymų tyrimo techniniame vadove pateikta išsami suderinamumo lentelė.

(Vertimas tęsiasi toliau tuo pačiu principu)

Nuorodos

  1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT ir kt. „Baltymų matavimas naudojant bicinchonininę rūgštį." Analitinė biochemija. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7

  2. Thermo Scientific. „Pierce BCA baltymų tyrimo rinkinys." Instrukcijos. Prieinama adresu: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf

  3. Walker JM. „Bicinchonininės rūgšties (BCA) tyrimas baltymų kiekybiniam nustatymui." Knygoje: Walker JM, red. Baltymų protokolų vadovas. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3

  4. Olson BJ, Markwell J. „Baltymų koncentracijos nustatymo tyrimai." Dabartiniai baltymų mokslo protokolai. 2007;Skyrius 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48

  5. Noble JE, Bailey MJ. „Baltymų kiekybinis nustatymas." Fermentų tyrimo metodai. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

Supaprastinkite baltymų kiekybinio įvertinimo darbo eigą

BCA tyrimai suteikia baltymų koncentracijas, tačiau jums vis dar reikia konvertuoti tuos skaičius į pipetavimo tūrius jūsų faktiniams eksperimentams. Šis skaičiuotuvas akimirksniu atlieka šią konversiją, nesvarbu, ar ruošiate vieną vakarų blotą, ar skaičiuojate tūrius 96 mėginiams vienu metu. Įveskite savo absorbcijos rodmenis, nurodykite tikslinius baltymų kiekius ir gaukite tikslų tūrį nuosekliems eksperimentiniams rezultatams.