Apskaičiuokite tikslius mėginio tūrius remiantis BCA analizės absorbcijos rodmenimis ir norima baltymų mase. Būtina nuosekliam baltymų krovimui vakarinėse blotų analizėse ir kitose laboratorinėse taikymuose.
Šis įrankis apskaičiuoja reikiamą mėginių tūrį, remiantis BCA absorbcijos rezultatais ir mėginių mase. Įveskite absorbcijos vertę ir mėginio masę kiekvienam mėginiui, kad apskaičiuotumėte atitinkamą mėginio tūrį.
Mėginio tūris apskaičiuojamas naudojant šią formulę:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA absorbancijos mėginio tūrio skaičiuoklė yra specializuotas įrankis, sukurtas padėti tyrėjams ir laboratorijų technikams tiksliai nustatyti tinkamą mėginio tūrį eksperimentams, remiantis BCA (bicinchonino rūgšties) analizės rezultatais. Ši skaičiuoklė naudoja jūsų BCA analizės absorbancijos rodmenis ir norimą mėginio masę, kad apskaičiuotų tikslią tūrį, reikalingą nuosekliam baltymų apkrovimui tokiuose taikymuose kaip vakarų blotavimas, fermentiniai bandymai ir kitos baltymų analizės technikos.
BCA analizė yra viena plačiausiai naudojamų metodų baltymų kiekiui nustatyti biochemijos ir molekulinės biologijos laboratorijose. Išmatuodami savo baltymų mėginių absorbanciją ir palygindami juos su standartine kreive, galite nustatyti baltymų koncentraciją su didele tikslumu. Mūsų skaičiuoklė supaprastina šį procesą automatiškai konvertuodama absorbancijos rodmenis į tikslius mėginių tūrius, reikalingus jūsų eksperimentams.
Bicinchonino rūgšties (BCA) analizė yra biocheminis metodas, skirtas nustatyti bendrą baltymų koncentraciją tirpale. Šio metodo principas remiasi Cu²⁺-baltymo komplekso susidarymu šarminėmis sąlygomis, po kurio Cu²⁺ yra redukuojamas į Cu¹⁺. Redukcijos kiekis yra proporcingas esamam baltymui. BCA sudaro violetinį kompleksą su Cu¹⁺ šarminėje aplinkoje, suteikdama pagrindą stebėti vario redukciją baltymais.
Violetinės spalvos intensyvumas didėja proporcingai baltymų koncentracijai, kuri gali būti matuojama naudojant spektrofotometrą maždaug 562 nm. Tada absorbancijos rodmenys palyginami su standartine kreive, kad būtų nustatyta baltymų koncentracija nežinomuose mėginiuose.
Pagrindinė formulė, skirta skaičiuoti mėginio tūrį iš BCA absorbancijos rezultatų, yra:
Kur:
Baltymų koncentracija apskaičiuojama iš absorbancijos rodmens naudojant standartinės kreivės lygtį:
Standartinei BCA analizei būdinga nuolatinė yra maždaug 2.0, o interceptas dažnai yra arti nulio, nors šios vertės gali skirtis priklausomai nuo jūsų konkrečių analizės sąlygų ir standartinės kreivės.
Mūsų skaičiuoklė supaprastina mėginio tūrių nustatymo procesą iš BCA analizės rezultatų. Sekite šiuos žingsnius, kad gautumėte tikslius skaičiavimus:
Įveskite mėginio informaciją:
Pasirinkite standartinės kreivės tipą:
Peržiūrėkite rezultatus:
Kopijuoti arba eksportuoti rezultatus:
Pažvelkime į praktinį pavyzdį:
Tai reiškia, kad turėtumėte įkelti 13.33 μL savo mėginio, kad gautumėte 20 μg baltymo.
Skaičiuoklė pateikia kelis svarbius duomenis:
Baltymų koncentracija: tai apskaičiuojama iš jūsų absorbancijos rodmens naudojant pasirinktos standartinės kreivės. Ji atspindi baltymo kiekį vienam tūrio vienetui jūsų mėginyje (μg/μL).
Mėginio tūris: tai yra jūsų mėginio tūris, kuriame yra norimas baltymo kiekis. Ši vertė yra tai, ką naudosite ruošdami savo eksperimentus.
Įspėjimai ir rekomendacijos: skaičiuoklė gali pateikti įspėjimus dėl:
Vienas iš dažniausiai naudojamų šios skaičiuoklės taikymų yra mėginių ruošimas vakarų blotavimui. Nuoseklus baltymų apkrovimas yra būtinas patikimiems vakarų blotų rezultatams, o ši skaičiuoklė užtikrina, kad įkeltumėte tą patį baltymo kiekį kiekvienam mėginiui, net jei jų koncentracijos skiriasi.
Pavyzdinė darbo eiga:
Fermentiniams bandymams dažnai būtina naudoti tam tikrą baltymo kiekį, kad būtų standartizuotos reakcijos sąlygos tarp skirtingų mėginių ar eksperimentų.
Pavyzdinė darbo eiga:
Imunoprecipitation (IP) eksperimentuose svarbu pradėti nuo nuoseklaus baltymo kiekio, kad būtų galima palyginti rezultatus tarp skirtingų sąlygų.
Pavyzdinė darbo eiga:
Baltymų valymo metu dažnai reikia stebėti baltymų koncentraciją ir apskaičiuoti derlių skirtinguose etapuose.
Pavyzdinė darbo eiga:
Nors skaičiuoklė teikia numatytus parametrus standartinėms BCA analizėms, taip pat galite įvesti pasirinktines vertes, jei sukūrėte savo standartinę kreivę. Tai ypač naudinga, kai:
Naudojant pasirinktines standartines kreives:
Skaičiuoklė leidžia pridėti kelis mėginius ir apskaičiuoti jų tūrius vienu metu. Tai ypač naudinga, kai ruošiate mėginius eksperimentams, kuriems reikia nuoseklaus baltymo apkrovimo tarp kelių sąlygų.
Partijų apdorojimo privalumai:
Jei jūsų absorbancijos rodmuo viršija 2.0, jis gali būti už BCA analizės linijinio diapazono. Tokiais atvejais:
Jei absorbancijos rodmuo yra žemesnis nei 0.1, galbūt esate arti analizės aptikimo ribos, kas gali paveikti tikslumą. Apsvarstykite:
Jei skaičiuoklė rodo tūrius, kurie yra per dideli jūsų taikymui:
Tiksli baltymų kiekių nustatymas buvo pagrindinis reikalavimas biochemijoje ir molekulinėje biologijoje nuo šių sričių atsiradimo. Ankstyvieji metodai remiasi azoto kiekio nustatymu, kuris buvo laiko reikalaujantis ir reikalavo specializuotos įrangos.
Kjeldahl metodas (1883): Vienas iš ankstyviausių baltymų kiekių nustatymo metodų, pagrįstas azoto kiekio matavimu.
Biuret testas (XX a. pradžia): Šis metodas remiasi reakcija tarp peptidinių ryšių ir vario jonų šarminėje tirpale, sukuriant violetinę spalvą.
Lowry analizė (1951): Sukūrė Oliveris Lowry, šis metodas sujungė Biuret reakciją su Folin-Ciocalteu reagentu, padidindamas jautrumą.
Bradford analizė (1976): Marion Bradford sukūrė šį metodą, naudodama Coomassie Brilliant Blue G-250 dažus, kurie jungiasi su baltymais ir keičia absorbcijos maksimumą.
BCA analizė (1985): Sukūrė Paul Smith ir kolegos iš Pierce Chemical Company, šis metodas sujungė biuret reakciją su BCA aptikimu, siūlydamas padidintą jautrumą ir suderinamumą su plovikliais.
BCA analizė pirmą kartą buvo aprašyta 1985 m. straipsnyje, kurį parašė Smith ir kt. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Ji buvo sukurta siekiant spręsti esamų metodų trūkumus, ypač trukdžių iš įvairių cheminių medžiagų, dažnai naudojamų baltymų ekstrakcijoje ir valyme.
Pagrindinis naujovė buvo bicinchonino rūgšties naudojimas aptikti Cu¹⁺ jonus, kuriuos sukelia baltymo sukeltas Cu²⁺ redukcija, formuojant violetinį kompleksą, kurį galima matuoti spektrofotometriškai. Tai suteikė keletą privalumų:
Nuo savo pristatymo BCA analizė tapo viena plačiausiai naudojamų baltymų kiekių nustatymo metodų biochemijos ir molekulinės biologijos laboratorijose visame pasaulyje.
1=IF(B2<=0,"Klaida: Neteisinga absorbancija",IF(C2<=0,"Klaida: Neteisinga mėginio masė",C2/(2*B2)))
2
3' Kur:
4' B2 yra absorbancijos rodmuo
5' C2 yra norima mėginio masė μg
6' Formulė grąžina reikiamą mėginio tūrį μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Apskaičiuokite baltymų koncentraciją iš absorbancijos naudojant standartinę kreivę."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbancija negali būti neigiama")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Apskaičiuokite reikiamą mėginio tūrį remiantis absorbancija ir norima mase."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Mėginio masė turi būti teigiama")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Pavyzdžio naudojimas
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Absorbancijai {absorbance} ir norimam baltymo masei {sample_mass} μg:")
31 print(f"Baltymų koncentracija: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Reikalingas mėginio tūris: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Klaida: {e}")
351# Funkcija baltymų koncentracijai apskaičiuoti iš absorbancijos
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbancija negali būti neigiama")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcija mėginio tūriui apskaičiuoti
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Mėginio masė turi būti teigiama")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Pavyzdžio naudojimas
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Absorbancijai %.2f ir norimam baltymo masei %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Baltymų koncentracija: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Reikalingas mėginio tūris: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Klaida: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbancija negali būti neigiama");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Mėginio masė turi būti teigiama");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Apskaičiuota baltymų koncentracija turi būti teigiama");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Pavyzdžio naudojimas
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Absorbancijai ${absorbance} ir norimam baltymo masei ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Baltymų koncentracija: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Reikalingas mėginio tūris: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Klaida: ${error.message}`);
37}
38Ryšys tarp absorbancijos ir baltymų koncentracijos paprastai yra linijinis tam tikrame diapazone. Žemiau pateikiama standartinės BCA kreivės vizualizacija:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Skirtingi baltymų kiekių nustatymo metodai turi įvairių privalumų ir trūkumų. Štai kaip BCA analizė palyginama su kitais dažnai naudojamais metodais:
| Metodas | Jautrumo diapazonas | Privalumai | Trūkumai | Geriausiai tinka |
|---|---|---|---|---|
| BCA analizė | 5-2000 μg/mL | • Suderinama su plovikliais • Mažesnė baltymų variacija • Stabilus spalvos vystymasis | • Trukdo redukuojantys agentai • Paveikta kai kurių chelatuojančių agentų | • Bendras baltymų kiekių nustatymas • Mėginiai, kuriuose yra ploviklių |
| Bradford analizė | 1-1500 μg/mL | • Greitas (2-5 min) • Mažai trukdančių medžiagų | • Didelė baltymų variacija • Nesuderinama su plovikliais | • Greiti matavimai • Mėginiai be ploviklių |
| Lowry metodas | 1-1500 μg/mL | • Gerai žinomas • Geras jautrumas | • Daug trukdančių medžiagų • Daug žingsnių | • Istorinis nuoseklumas • Gryni baltymų mėginiai |
| UV absorbancija (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Nedestruktyvus • Labai greitas • Reikia jokių reagentų | • Paveikta nukleorūgščių • Reikalauja grynų mėginių | • Gryni baltymų tirpalai • Greiti patikrinimai valymo metu |
| Fluorometrinis | 0.1-500 μg/mL | • Didžiausias jautrumas • Platus dinaminis diapazonas | • Brangūs reagentai • Reikia fluorometro | • Labai skiedžiami mėginiai • Ribotas mėginio tūris |
BCA (bicinchonino rūgšties) analizė pirmiausia naudojama nustatyti bendrą baltymų koncentraciją mėginyje. Ji plačiai naudojama biochemijoje, ląstelių biologijoje ir molekulinėje biologijoje tokiose taikymuose kaip vakarų blotavimas, fermentiniai bandymai, imunoprecipitation ir baltymų valymas.
BCA analizė paprastai yra tiksli per 5-10%, kai atliekama teisingai. Jos tikslumas priklauso nuo kelių veiksnių, įskaitant standartinės kreivės kokybę, trukdančių medžiagų nebuvimą ir ar nežinomo baltymo sudėtis yra panaši į naudojamo standartinio baltymo.
Kelios medžiagos gali trukdyti BCA analizės rezultatams, įskaitant:
Pagrindiniai skirtumai yra:
Jei jūsų skaičiuoklė rodo labai didelį mėginio tūrį, tai paprastai rodo, kad jūsų mėginyje yra mažai baltymų koncentracijos. Tai gali būti dėl:
Apsvarstykite galimybę koncentruoti savo mėginį arba sumažinti norimą baltymo kiekį, jei jūsų eksperimentas leidžia.
Ši skaičiuoklė specialiai sukurta BCA analizės rezultatams. Nors pagrindinė principas (koncentracijos konvertavimas į tūrį) taikomas ir kitiems metodams, ryšys tarp absorbancijos ir baltymų koncentracijos skiriasi tarp skirtingų analizių. Kitiems metodams, tokiems kaip Bradford ar Lowry, reikės naudoti skirtingas standartinės kreivės parametrus.
Jei absorbancijos rodmenys yra už linijinio diapazono (paprastai >2.0):
Bovine serum albuminas (BSA) yra dažniausiai naudojamas standartas BCA analizėms, nes jis yra:
Tačiau, jei jūsų mėginiai turi dominuojantį baltymą, kuris žymiai skiriasi nuo BSA, apsvarstykite galimybę naudoti tą baltymą kaip savo standartą, kad gautumėte tikslesnius rezultatus.
Violetinė spalva, išsivysčiusi BCA reakcijoje, yra stabili kelias valandas kambario temperatūroje ir gali būti matuojama bet kuriuo metu per tą laikotarpį. Tačiau geriausiems rezultatams rekomenduojama matuoti visus standartus ir mėginius maždaug tuo pačiu metu po spalvos vystymosi.
Nors techniškai galima pakartotinai naudoti standartinę kreivę, tai nerekomenduojama, kad būtų užtikrinti tikslesni kiekių nustatymai. Reagentų, inkubacijos sąlygų ir prietaisų kalibravimo svyravimai gali paveikti ryšį tarp absorbancijos ir baltymų koncentracijos. Patikimiems rezultatams kiekvieną kartą atlikdami analizę sukurkite naują standartinę kreivę.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instrukcijos. Prieinama adresu: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Dabar, kai suprantate principus, susijusius su BCA baltymų kiekių nustatymu ir mėginio tūrio skaičiavimu, išbandykite mūsų skaičiuoklę, kad supaprastintumėte savo laboratorijos darbo eigą. Tiesiog įveskite savo absorbancijos rodmenis ir norimą mėginio masę, kad gautumėte akimirksniu, tikslius mėginio tūrio skaičiavimus.
Ar ruošiate mėginius vakarų blotavimui, fermentiniams bandymams ar bet kuriam kitam baltymų pagrindu paremtam eksperimentui, mūsų skaičiuoklė padės užtikrinti nuoseklius ir patikimus rezultatus. Sutaupykite laiko, sumažinkite klaidas ir pagerinkite savo eksperimentų reprodukuojamumą su BCA absorbancijos mėginio tūrio skaičiuokle.
Raskite daugiau įrankių, kurie gali būti naudingi jūsų darbo eiga.