Šūnu Atšķaidīšanas Kalkulators - Precīzs Laboratorijas Atšķaidīšanas Rīks

Šūnu atšķaidīšanas kalkulators

Šūnu atšķaidīšanas kalkulators nosaka, cik daudz šūnu suspensijas un cik daudz atšķaidītāja jāsajauc, lai izvēlētajā galīgajā tilpumā sasniegtu noteiktu šūnu koncentrāciju. To izmanto šūnu kultūrā, mikrobioloģijā un citos laboratorijas darbos, kuros paraugs pirms lietošanas jāpielāgo precīzai koncentrācijai.

Ko nozīmē šūnu atšķaidīšana

Šūnu suspensijas atšķaidīšana nemaina tajā esošo šūnu skaitu. Tā maina tikai tilpumu, kurā šūnas atrodas, tādējādi samazinot koncentrāciju. Suspensija, kurā noteiktas 1 000 000 šūnas mililitrā (šūnas/ml), pēc atšķaidīšanas joprojām satur tādu pašu kopējo šūnu skaitu. Šis skaits vienkārši tiek izkliedēts lielākā šķidruma tilpumā.

Laboratorijās šūnas atšķaida pirms daudziem ikdienas darba posmiem: augošas kultūras sadalīšanas jaunās kolbās, noteikta šūnu skaita iesēšanas katrā plates iedobītē, šūnu sasaldēšanas uzglabāšanai vai parauga sagatavošanas šūnu skaitītājam vai plūsmas citometram.

Šūnu atšķaidīšanas formula

Aprēķina pamatā ir viens noteikums. No sākotnējās suspensijas paņemto šūnu skaitam, kas reizināts ar tās koncentrāciju, jābūt vienādam ar šūnu skaitu galīgajā tilpumā, kas reizināts ar mērķa koncentrāciju:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — sākotnējā (izejas) koncentrācija šūnās/ml
• V₁ — izmantojamās izejas suspensijas tilpums ml
• C₂ — mērķa koncentrācija šūnās/ml
• V₂ — nepieciešamais kopējais galīgais tilpums ml

Atrisinot vienādojumu attiecībā uz V₁, iegūst ar pipeti paņemamās izejas suspensijas tilpumu:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Pārējo galīgā tilpuma daļu veido atšķaidītājs, parasti šūnu kultūras barotne, fosfātu buferšķīdums (PBS) vai cits buferšķīdums:

Atšķaidītāja tilpums = V₂ − V₁

Mērķa koncentrācija (C₂) nekad nevar būt lielāka par izejas koncentrāciju (C₁). Atšķaidīšana koncentrāciju tikai samazina. Lai to palielinātu, šūnas jācentrifugē un atkārtoti jāresuspendē mazākā šķidruma tilpumā.

Kā aprēķināt šūnu atšķaidījumu

1. Saskaitiet šūnas izejas suspensijā, izmantojot hemocitometru vai automātisku šūnu skaitītāju, lai iegūtu C₁.
2. Norādiet protokolā prasīto mērķa koncentrāciju C₂.
3. Nosakiet nepieciešamo kopējo galīgo tilpumu V₂.
4. Aprēķiniet V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Aprēķiniet atšķaidītāja tilpumu kā V₂ − V₁.
6. Ar pipeti pārnesiet V₁ izejas suspensijas mēģenē, pēc tam pievienojiet barotnes vai buferšķīduma atšķaidītāja tilpumu.

Aprēķina piemērs

Izejas suspensijā noteiktas 1 000 000 šūnas/ml. Protokolā nepieciešamas 100 000 šūnas/ml galīgajā tilpumā 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Atšķaidītāja tilpums = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Paņemot 1 mL izejas suspensijas un pievienojot 9 mL barotnes, iegūst 10 mL suspensijas ar koncentrāciju 100 000 šūnas/ml.

Otrs piemērs

Analīzei 96 iedobju platē katrā iedobītē nepieciešamas 10 000 šūnas 200 mikrolitros (μL) barotnes. Tā ir mērķa koncentrācija 50 000 šūnu/ml, jo 10 000 šūnu dalījums ar 0,2 mL ir 50 000 šūnu/ml. Izejas suspensijas koncentrācija ir 2 000 000 šūnu/ml, un plates pārklāšanai ar nelielu rezervi pipetēšanas zudumiem nepieciešami kopumā 20 mL.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Atšķaidītāja tilpums = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Sajaucot 0,5 mL izejas suspensijas ar 19,5 mL barotnes, iegūst 20 mL ar koncentrāciju 50 000 šūnu/ml, kas ir atšķaidījums 1 pret 40.

Kļūdu avoti

Pati formula ir precīza. Kļūdas rodas no tajā ievadītajiem skaitļiem.

• Skaitīšanas kļūda. Nepareizs šūnu skaits tieši rada nepareizu atšķaidījumu. Šo risku samazina visu četru hemocitometra režģa stūra kvadrātu saskaitīšana un to vidējā aprēķināšana.
• Salipušas šūnas. Šūnu sakopojums mikroskopā izskatās kā viena šūna, lai gan patiesībā sastāv no vairākām, tāpēc šķietamā koncentrācija tiek novērtēta par zemu.
• Pipetes diapazons. Pipete, ko izmanto ārpus tās norādītā tilpuma diapazona, dod neprecīzus rezultātus. 1000 μL pipete, kas iestatīta 5 μL izsniegšanai, nav uzticama; tā vietā jāizmanto mazāka pipete.
• Mērvienību sajaukšana. Šūnu/ml sajaukšana ar šūnām/μl rada kļūdu, kas ir tūkstoš reižu par lielu vai par mazu.
• Nedzīvas šūnas. Neapstrādāts šūnu skaits ietver arī nedzīvās šūnas, ja vien nav izmantota dzīvotspējas krāsviela, piemēram, tripāna zilais. Tādēļ faktiskais dzīvo šūnu skaits var tikt pārvērtēts.

Šī kalkulatora ierobežojumi

Kalkulators noraida skaitļus, no kuriem nevar iegūt lietderīgu atbildi:

• Katrai vērtībai jābūt lielākai par nulli.
• Mērķa koncentrācija nevar būt lielāka par sākotnējo koncentrāciju.
• Sākotnējā koncentrācija nedrīkst pārsniegt 1 triljonu šūnu/ml (1 × 10¹²).
• Aprēķinātajam izejas suspensijas tilpumam jābūt vismaz 0,001 mL jeb 1 mikrolitram. Mazāku tilpumu nevar precīzi paņemt ar pipeti, tāpēc kalkulators lūdz ievadīt citus skaitļus. Parasti šo problēmu atrisina kopējā tilpuma palielināšana.

Tilpumi tiek rādīti ar divām zīmēm aiz komata vai ar trim, ja izejas suspensijas tilpums ir mazāks par 0,01 mL, lai mazs tilpums nekad netiktu parādīts kā 0,00 mL.

Biežāk uzdotie jautājumi

Kāda ir šūnu atšķaidīšanas formula?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, kur C₁ un C₂ ir sākotnējā un mērķa koncentrācija, bet V₁ un V₂ ir no izejas suspensijas paņemtais tilpums un kopējais galīgais tilpums.

Vai mērķa koncentrācija var būt lielāka par sākotnējo koncentrāciju?

Nē. Atšķaidīšana koncentrāciju tikai samazina. Lai sasniegtu lielāku koncentrāciju, šūnas jācentrifugē un atkārtoti jāresuspendē mazākā tilpumā.

Kāds šķidrums jāizmanto šūnu atšķaidīšanai?

Pilnvērtīgu kultūras barotni izmanto, ja šūnām jāpaliek dzīvotspējīgām stundām vai dienām, piemēram, pirms plates iesēšanas. PBS vai līdzīgs buferēts sālsšķīdums ir piemērots īslaicīgai atšķaidīšanai, aptuveni līdz 30 minūtēm, pirms šūnas tiek tālāk apstrādātas. Barotni bez seruma izmanto, ja seruma olbaltumvielas traucētu turpmākai analīzei.

Vai šī formula darbojas baktērijām vai raugiem?

Jā. C₁V₁ = C₂V₂ attiecas uz jebkuru daļiņu suspensiju, tostarp baktērijām, ko mēra koloniju veidojošās vienībās mililitrā (KVV/ml), raugiem un vīrusu daļiņām, ko mēra plāksnīšu veidojošās vienībās mililitrā (PFU/ml), ja vien abās vienādojuma pusēs izmanto vienādas mērvienības.

Vai atšķaidījumā jāskaita nedzīvās šūnas?

Dzīvas kultūras iesēšanai jāskaita tikai dzīvotspējīgās šūnas. Ja suspensijas dzīvotspēja ir 80%, tās dzīvotspējīgā koncentrācija veido 0,8 no kopējā šūnu skaita, un šī dzīvotspējīgā koncentrācija jāizmanto kā C₁.

Kā precīzi veikt ļoti lielus atšķaidījumus?

Lielus atšķaidījumus, piemēram, 1 pret 1000, parasti veic vairākos mazākos posmos, ko sauc par sērijveida atšķaidīšanu. Trīs secīgi 1 pret 10 atšķaidījumi kopumā dod 1 pret 1000, vienlaikus saglabājot katru pipetēšanas posmu precīzi veicamā tilpuma diapazonā.