Enzīmu Aktivitātes Kalkulators - Mihelis-Mentena Kinētika

Enzīma aktivitātes kalkulators

Enzīma aktivitātes kalkulators nosaka, cik ātri enzīms pārvērš substrātu produktā; rezultātu izsaka kā īpatnējo aktivitāti vienībās uz miligramu (U/mg). Tas izmanto Mihaēla–Mentenas vienādojumu, kas ir enzīmu kinētikas standarta modelis, kā arī enzīma olbaltumvielu daudzumu paraugā.

Enzīmi ir olbaltumvielas, kas paātrina ķīmiskās reakcijas šūnās, pašas neizlietojoties. Zinātnieki mēra enzīma aktivitāti, lai salīdzinātu dažādas partijas, pārbaudītu, vai attīrīšanas posms ir bijis sekmīgs, vai noteiktu, kā zāles ietekmē enzīma darbības ātrumu. Enzīma koncentrācija pati par sevi neparāda, vai enzīms pilda savu funkciju. To parāda īpatnējā aktivitāte.

Ko aprēķina kalkulators

Šis rīks izmanto piecus ievades parametrus: enzīma koncentrāciju, substrāta koncentrāciju, Mihaēla konstanti (Km), maksimālo ātrumu (Vmax) un reakcijas laiku. Reakcijas laiks tiek reģistrēts uzziņai, bet formulā netiek izmantots. Vmax jau ir ātrums — substrāta daudzums, kas pārvērsts minūtē, — tāpēc laiks tajā jau ir ietverts. Dalīšana ar laiku vēlreiz to ieskaitītu divas reizes.

Kalkulators atgriež vienu skaitli un vienu diagrammu:

• Īpatnējā aktivitāte, izteikta U/mg. Tas ir reakcijas ātrums, dalīts ar klātesošo enzīma olbaltumvielu daudzumu.
• Diagramma, kurā attēlots reakcijas ātrums atkarībā no substrāta koncentrācijas, parādot līknes zemo, pārejas un piesātināto daļu. Tajā ir atzīmēts ātrums ievadītajai substrāta koncentrācijai.

Kā aprēķināt enzīma aktivitāti

Maikla–Mentenas vienādojums

Leonors Mihaēlis un Mauda Mentena publicēja šo modeli 1913. Tas apraksta, kā enzīma reakcijas ātrums ir atkarīgs no substrāta koncentrācijas:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = reakcijas ātrums pie noteiktas substrāta koncentrācijas
• $V_{max}$ = maksimālais ātrums, kad enzīms ir pilnībā piesātināts ar substrātu
• $[S]$ = substrāta koncentrācija
• $K_m$ = Mihaēla konstante: substrāta koncentrācija, pie kuras ātrums ir puse no Vmax vērtības

Īpatnējās aktivitātes formula

Īpatnējā aktivitāte ir šis ātrums, dalīts ar klātesošo enzīma olbaltumvielu daudzumu, un rezultātu izsaka vienībās uz miligramu (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Šeit $A$ ir specifiskā aktivitāte, bet $[E]$ — enzīma koncentrācija.

Viena enzīma vienība (U) ir tāds enzīma daudzums, kas minūtē katalizē 1 mikromola (µmol) substrāta pārvēršanu. Šo definīciju noteica Starptautiskā bioķīmijas un molekulārās bioloģijas savienība (IUBMB).

Vienības veidojas šādi. Mihaēla–Mentenas vienādojumā ātruma mērvienības ir substrāta koncentrācija, dalīta ar laiku. Kalkulators izmanto [S] un Km mM, tāpēc Vmax un v ir izteikti µmol minūtē uz mililitru, ko pieraksta µmol/(min·mL). Tas ir tas pats, kas mM/min, un arī tas pats, kas U/mL. Enzīma koncentrācija [E] ir mg/mL. Dalot, mililitri saīsinās:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax jau ietver lielumu “uz minūti”, tāpēc formulā nav vajadzīgs atsevišķs laika loceklis.

Šajā aprēķinā pieņemts, ka izmērītais ātrums ir sākotnējais ātrums, kas noteikts reakcijas sākumā, pirms substrāta kļūst maz vai produkts sāk inhibēt enzīmu. Laboratorijās parasti mēra pirmos 5–10% substrāta pārveides, lai paliktu šajā lineārajā diapazonā.

Aprēķina piemērs

Piemērs 1. Enzīma koncentrācija 1 mg/mL, substrāta koncentrācija 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Tās ir kalkulatora sākotnējās vērtības.

Ātrums = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Īpatnējā aktivitāte = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Piemērs 2. Tie paši nosacījumi, bet enzīma koncentrācija palielināta divas reizes — līdz 2 mg/mL.

Ātrums = 33,33 µmol/(min·mL), nemainīgs, jo šajā vienādojumā ātrums nav atkarīgs no [E]. Īpatnējā aktivitāte = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Divkāršojot enzīma daudzumu, īpatnējā aktivitāte samazinās uz pusi, jo tas pats kopējais ātrums tagad tiek dalīts ar divreiz lielāku olbaltumvielu daudzumu.

Piemērs 3. Substrāta koncentrācija palielināta līdz 100 mM, kas ir krietni virs Km, enzīma koncentrācijai esot 1 mg/mL, Km 5 mM un Vmax 50 µmol/(min·mL).

Ātrums = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Īpatnējā aktivitāte = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Pie augstas substrāta koncentrācijas enzīms ir gandrīz piesātināts, tāpēc ātrums ir tuvs Vmax.

Piemērs 4. Substrāta koncentrācija samazināta līdz 1 mM, kas ir zem Km, enzīma koncentrācijai esot 1 mg/mL, Km 5 mM un Vmax 50 µmol/(min·mL).

Ātrums = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Īpatnējā aktivitāte = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Ja koncentrācija ir zem Km, nelielais substrāta daudzums ierobežo reakciju, tāpēc gan ātrums, gan īpatnējā aktivitāte ir daudz mazāki par Vmax.

Galveno parametru skaidrojums

Enzīma koncentrācija [E] ir enzīma olbaltumvielu masa uz tilpuma vienību, ko izsaka mg/mL. Lielāka vērtība nozīmē, ka tas pats reakcijas ātrums tiek sadalīts starp lielāku olbaltumvielu daudzumu, tādējādi samazinot īpatnējo aktivitāti. Tas, vai enzīma preparāts darbojas labi, parāda īpatnējā aktivitāte, nevis vienkārši koncentrācija.

Substrāta koncentrācija [S] ir substrāta daudzums, ar kuru enzīms var darboties, parasti izteikts mM. Ja [S] ir zema, neliels pieaugums strauji palielina ātrumu. Tuvojoties piesātinājumam, papildu substrāts dod tikai nelielu ieguvumu.

Mihaēla konstante (Km) ir substrāta koncentrācija, pie kuras ātrums ir vienāds ar pusi no Vmax. Zems Km nozīmē, ka enzīms sasniedz pusi no maksimālā ātruma pie zemas substrāta koncentrācijas, kas liecina par ciešu saistīšanos starp enzīmu un substrātu. Piemēram, heksokināzes Km glikozei ir aptuveni 0,1 mM, kas liecina par augstu afinitāti.

Maksimālais ātrums (Vmax) ir ātrums apstākļos, kad substrāts vairs nav ierobežojošais faktors. Ievadiet to µmol/(min·mL), kas ir tas pats, kas mM/min vai U/mL, lai mērvienība atbilstu mM, kas izmantots [S] un Km. Tas ir atkarīgs no enzīma daudzuma un no tā, cik ātri katra enzīma molekula var pārveidot substrātu (ko raksturo tās aprites skaitlis, kcat).

Reakcijas laiks ir laiks, cik ilgi notika tests. Tas palīdz plānot eksperimentu, jo pārāk ilgi turpināta reakcija var izsmelt substrātu un vairs nenotikt lineāri. Tas pats par sevi nav daļa no īpatnējās aktivitātes formulas.

Ātruma līknes nolasīšana

Diagrammā, izmantojot Mihaēla–Mentenas vienādojumu, attēlots ātrums atkarībā no substrāta koncentrācijas.

• Zem Km: ātrums aptuveni proporcionāli palielinās līdz ar substrāta koncentrāciju. Nelielas kļūdas substrāta koncentrācijā rada lielas kļūdas rezultātā.
• Km tuvumā: līkne izliecas. Ātrums ir puse no Vmax.
• Virs Km: līkne kļūst plakana. Papildu substrāts rada tikai nelielu ātruma pieaugumu, jo enzīms ir gandrīz piesātināts.

Kāpēc īpatnējā aktivitāte ir svarīga

Īpatnējā aktivitāte ir standarta enzīma tīrības un kvalitātes rādītājs. Attīrīšanas laikā zinātnieki to nosaka katrā posmā: neattīrīts šūnu ekstrakts var uzrādīt dažas U/mg, savukārt ļoti tīrs paraugs var sasniegt simtus vai tūkstošus U/mg. Īpatnējās aktivitātes pieaugums attīrīšanas procesa laikā rāda, ka neaktīvās olbaltumvielas tiek atdalītas, saglabājot pētāmo enzīmu.

Tas pats mērījums tiek izmantots zāļu izstrādē, kur pētnieki pārbauda, kā kandidātvielas samazina enzīma aktivitāti, kā arī klīniskajā diagnostikā, kur ārsti asinīs mēra tādus enzīmus kā ALT un AST, lai pārbaudītu aknu bojājumus.

Biežāk uzdotie jautājumi

Kā aprēķināt enzīma aktivitāti, izmantojot Km un Vmax? Vispirms ar Mihaēla–Mentenas vienādojumu aprēķina reakcijas ātrumu: v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Pēc tam izdaliet to ar enzīma koncentrāciju, lai iegūtu īpatnējo aktivitāti U/mg: aktivitāte = v / [E]. Vmax izsakiet µmol/(min·mL), bet [E] — mg/mL, lai mērvienības saīsinātos līdz U/mg.

Kas ir enzīma aktivitātes vienība (U)? Viena vienība ir tāds enzīma daudzums, kas noteiktos apstākļos minūtē pārvērš 1 µmol substrāta, kā definējusi IUBMB.

Kāpēc formulā nav iekļauts reakcijas laiks? Vmax jau ir izteikts kā daudzums minūtē, tātad tas ir ātrums, nevis kopējais daudzums. Dalot ar laiku vēlreiz, tas tiktu ieskaitīts divas reizes, un rezultāts būtu atkarīgs no testa ilguma, kam nevajadzētu notikt, ja tiek raksturota paša enzīma īpašība.

Kāpēc, palielinoties enzīma koncentrācijai, īpatnējā aktivitāte samazinās? Mihaēla–Mentenas vienādojumā ātrums nav atkarīgs no enzīma koncentrācijas. Īpatnējā aktivitāte šo nemainīgo ātrumu dala ar [E], tāpēc lielāka [E] dod mazāku rezultātu. Lai godīgi salīdzinātu dažādu koncentrāciju enzīmu preparātus, salīdzina īpatnējo aktivitāti, nevis vienkārši ātrumu.

Ko nozīmē zems Km? Zems Km nozīmē, ka enzīms sasniedz pusi no maksimālā ātruma pie zemas substrāta koncentrācijas, kas liecina par ciešu enzīma un substrāta saistīšanos.

Vai īpatnējā aktivitāte var būt negatīva? Nē. Negatīvs rezultāts norāda uz ievades kļūdu, piemēram, negatīvu koncentrāciju, vai aprēķina kļūdu, nevis uz reālu enzīma mērījumu.

Atsauces

1. Mihaēlis, L., un Mentena, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Bergs, J. M., Timočko, J. L., un Strīers, L. (2012). Bioķīmija (7. izdevums). W.H. Freeman and Company.
3. Starptautiskā bioķīmijas un molekulārās bioloģijas savienība (IUBMB). Enzīmu nomenklatūra. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. BRENDA enzīmu datubāze. https://www.brenda-enzymes.org/