DNS kopiju skaita kalkulators | Genomiskās analīzes rīks

DNS kopiju skaita kalkulators

DNS kopiju skaita kalkulators aprēķina, cik mērķa sekvences kopiju atrodas DNS paraugā. Tas izmanto parauga koncentrāciju, tilpumu un to, cik reižu mērķa sekvence parādās garākajā DNS sekvencē. Molekulārās bioloģijas laboratorijas šādu aprēķinu izmanto, lai plānotu tādus eksperimentus kā qPCR (kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija), pirms tiek veikta dārgāka un precīzāka analīze.

Ko nozīmē DNS kopiju skaits

DNS kopiju skaits ir reižu skaits, cik konkrēta sekvence parādās genomā vai paraugā. Tipisks cilvēka gēns parādās divas reizes — viena kopija tiek mantota no katra vecāka. Šo skaitu var mainīt vairāki faktori.

• Amplifikācija: vairāk nekā divas kopijas. Vēža šūnas bieži amplificē augšanu veicinošus gēnus, piemēram, HER2 dažos krūts audzējos.
• Delēcija: mazāk nekā divas kopijas, dažkārt neviena. Delēcijas var izraisīt ģenētiskus traucējumus.
• Duplikācija: parādās papildu kopija vietā, kur vajadzētu būt tikai vienai vai divām kopijām.
• Kopiju skaita variācija (CNV): normāla kopiju skaita atšķirība starp indivīdiem, kas sastopama nozīmīgā cilvēka genoma daļā.

DNS kopiju skaita formula

Kalkulators, izmantojot sekvences sastopamību un parauga masu, aprēķina kopiju skaitu pēc šādas formulas:

$\text{Kopiju skaits} = \frac{\text{Sastopamību skaits} \times \text{Koncentrācija} \times \text{Tilpums} \times N_A}{\text{DNS garums} \times 660 \times 10^{9}}$

Kur:

• Sastopamība — reižu skaits, cik mērķa sekvence parādās visā DNS sekvencē; pārklājošās atbilstības tiek skaitītas atsevišķi.
• Koncentrācija — DNS koncentrācija nanogramos uz mikrolitru (ng/μL), ko parasti nosaka ar spektrofotometru vai fluorometru.
• Tilpums — parauga tilpums mikrolitros (μL).
• $N_A$ — Avogadro skaitlis, 6,022 × 10²³ molekulas uz molu. Tas pārvērš DNS molu skaitu molekulu skaitā.
• DNS garums — visas DNS sekvences garums bāzu pāros.
• 660 — viena DNS bāzu pāra vidējā molekulmasa gramos uz molu (g/mol). Bāzu pāris sastāv no diviem sapārotiem nukleotīdiem — pa vienam no katras DNS virknes.
• 10⁹ — pārvērš nanogramus gramos.

Formula vispirms pārvērš parauga masu DNS molekulu molu skaitā, reizina to ar Avogadro skaitli, lai iegūtu kopējo DNS molekulu skaitu paraugā, un pēc tam reizina ar reižu skaitu, cik mērķa sekvence sastopama katrā molekulā.

Rīks pieņem tikai burtus A, T, C un G. Atstarpes un rindu pārtraukumi tiek ignorēti, un mazie burti tiek uzskatīti par tādiem pašiem kā lielie burti.

Kā aprēķināt DNS kopiju skaitu: aprēķina piemērs

Ņemsim 12 bāzu pāru garu DNS sekvenci ATCGATCGATCG ar mērķa sekvenci ATCG, koncentrāciju 10 ng/μL un tilpumu 20 μL.

Darbība 1: saskaitiet sastopamības. ATCG sekvence ATCGATCGATCG parādās 3 reizes — pozīcijās 1, 5 un 9.

Darbība 2: nosakiet kopējo DNS masu. Koncentrācija × tilpums = 10 × 20 = 200 ng.

Darbība 3: pārvērtiet molos. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Dalot ar (12 bāzu pāri × 660 g/mol) = 7 920 g/mol, iegūst 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Darbība 4: pārvērtiet molekulu skaitā. Reiziniet ar Avogadro skaitli: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekulas/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNS molekulas.

Darbība 5: reiziniet ar sastopamību skaitu. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³ jeb aptuveni 45 621 212 121 212 kopiju.

Šis skaitlis šķiet milzīgs, jo 20 μL paraugs ar koncentrāciju 10 ng/μL joprojām satur triljonus īsu DNS molekulu. Reālos paraugos parasti izmanto daudz garākas sekvences, tāpēc pie vienādas masas molekulu skaits ir mazāks.

Kur izmanto DNS kopiju skaita analīzi

Vēža diagnostika. Patoloģijas laboratorijas pārbauda HER2 kopiju skaitu krūts audzēja audos. Normāla šūna satur divas kopijas. Amplificēts audzējs var saturēt sešas vai vairāk kopiju, un tas ietekmē iespēju izmantot mērķterapijas zāles, piemēram, trastuzumabu.

Ģenētisko slimību diagnostika. Tādi stāvokļi kā DiDžordža sindroms ir saistīti ar hromosomas segmenta delēciju. Dauna sindromu izraisa 21. hromosomas papildu kopija (21. trisomija). Kopiju skaitīšana palīdz apstiprināt šīs diagnozes.

Transgēnu un plazmīdu kvantificēšana. Pētnieki pārbauda, cik ievietotā gēna kopiju ir nonākušas auga, dzīvnieka vai baktērijas šūnā. Parasti priekšroka tiek dota vienai kopijai, jo vairākas kopijas var izraisīt gēna apklusināšanu šūnā.

Patogēnu un vīrusu slodzes uzraudzība. Kopiju skaita aprēķini nosaka, cik daudz vīrusu vai baktēriju DNS atrodas paraugā; to izmanto infekciju uzraudzībā un vides testēšanā.

Citas kopiju skaita noteikšanas metodes

Šis kalkulators sniedz ātru aprēķinu, izmantojot sekvences un koncentrācijas datus. Laboratorijas, kurām nepieciešama lielāka precizitāte, parasti izmanto kādu no šīm metodēm:

• Kvantitatīvā PCR (qPCR): amplificē un mēra DNS reāllaikā; ar labu standartlīkni precizitāte ir aptuveni 15–20%.
• Digitālā PCR (dPCR): sadala paraugu tūkstošiem sīku reakciju tiešai skaitīšanai, neizmantojot standartlīkni.
• Fluorescences in situ hibridizācija (FISH): vizuāli saskaita sekvences mikroskopā tieši šūnās vai hromosomās; tā ir standarta metode daudzās vēža diagnostikas laboratorijās.
• Nākamās paaudzes sekvenēšana (NGS): sekvenē visu paraugu un vienlaikus nosaka kopiju skaitu visā genomā.

Biežāk uzdotie jautājumi

Kas ir DNS kopiju skaits? Tas ir reižu skaits, cik konkrēta DNS sekvence parādās genomā vai paraugā. Lielākā daļa cilvēka gēnu parādās divas reizes — pa vienai kopijai no katra vecāka. Papildu vai trūkstošas kopijas var ietekmēt veselību un slimību risku.

Cik precīzs ir šis kalkulators? Tas sniedz teorētisku aprēķinu, kas balstīts uz ievadītajiem datiem, nevis laboratorisku mērījumu. Precizitāte ir atkarīga no tā, cik precīzi noteikta koncentrācija un cik specifiska ir mērķa sekvence. Publicētiem rezultātiem precīzākas ir tādas metodes kā digitālā PCR.

Vai šo kalkulatoru var izmantot RNS aprēķiniem? Nē. RNS timīna vietā izmanto uracilu un citu cukuru, tāpēc tās molekulmasa atšķiras no DNS molekulmasas. RNS vidējā molekulmasa ir aptuveni 330 g/mol uz nukleotīdu, savukārt DNS bāzu pārim tā ir aptuveni 660 g/mol. Izmantojot DNS formulu RNS datiem, tiktu iegūts nepareizs rezultāts.

Kāpēc pārklājošās sekvences tiek skaitītas vairāk nekā vienu reizi? Kalkulators saskaita katru pozīciju, kurā mērķa sekvence atbilst, pat ja atbilstībām ir kopīgi burti. Sekvence ATA paraugā ATATAT atbilst divas reizes — pozīcijā 1 un pozīcijā 3, jo katra sākuma pozīcija tiek pārbaudīta neatkarīgi.

Kāds DNS koncentrācijas diapazons ir vispiemērotākais? Koncentrācijas 10–100 ng/μL nodrošina visuzticamākos rādījumus ar standarta laboratorijas instrumentiem. Ja koncentrācija ir mazāka par 10 ng/μL, mērījumu kļūda palielinās, tāpēc standarta spektrofotometra vietā ieteicams izmantot jutīgāku metodi, piemēram, fluorometru.

Vai ar šo kalkulatoru var aprēķināt plazmīdas kopiju skaitu? Jā. Kā DNS sekvenci ievadiet pilno plazmīdas sekvenci, bet kā mērķa sekvenci — unikālu ievietotā fragmenta reģionu, kā arī izmērīto plazmīdas koncentrāciju un parauga tilpumu.