Proteinløselighetsberegner - Gratis pH & Temperaturverktøy

En kalkulator for proteinløselighet anslår den høyeste konsentrasjonen av et protein som forblir oppløst i et løsemiddel ved en gitt pH, temperatur og ionestyrke. Den omgjør grunnleggende kjemi til ett enkelt tall, i milligram protein per milliliter løsemiddel.

Proteinløselighet er viktig innen biokjemi, legemiddelformulering og næringsmiddelteknologi. Et protein som ikke forblir oppløst, danner aggregater eller utfellinger, noe som kan ødelegge et eksperiment eller gjøre et legemiddel umulig å injisere.

Slik beregnes proteinløselighet

Løseligheten avhenger av fem ting: proteinets isoelektriske punkt (pH-en der nettoladningen er null), denatureringstemperaturen (temperaturen der det begynner å denaturere), løsemiddelets dielektrisitetskonstant (et mål på hvor godt det separerer ladde partikler), løsningens pH og ionestyrken (et mål på hvor mye oppløst salt som finnes).

Kalkulatoren tar utgangspunkt i hvert proteins kjente løselighet i vann ved et fastsatt sett referansebetingelser: 25 °C, pH 7,0 og en ionestyrke på 0,15 M (omtrent saltnivået i blod). Deretter multipliserer den denne referanseverdien med fire forholdstall, ett for hver betingelse som er endret.

Formel for proteinløselighet

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ er proteinets kjente løselighet i vann ved referansebetingelsene, i mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, der $pI$ er proteinets isoelektriske punkt. Løseligheten er lavest ved det isoelektriske punktet og øker når pH-en beveger seg bort fra dette punktet, før den flater ut innenfor et par pH-enheter.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, der $I$ er ionestyrken i mol per liter. Ved lave saltnivåer øker dette leddet løseligheten litt («salting in»). Ved høye saltnivåer reduserer det løseligheten («salting out»).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, der $T_m$ er proteinets smeltepunkt i °C. Løseligheten øker svakt med temperaturen, og faller deretter brått når temperaturen nærmer seg $T_m$ og proteinet begynner å folde seg ut.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, der $\varepsilon$ er løsemiddelets dielektrisitetskonstant. Vann har en dielektrisitetskonstant på 78,4, så dette leddet er lik 1 i vann. Løsemidler som separerer ladninger mindre effektivt enn vann, for eksempel etanol, reduserer løseligheten.

Referanseverdier som brukes av kalkulatoren

Løselighetskategorier

Eksempel: albumin i fosfatbuffer

Finn løseligheten til albumin i fosfatbuffer ved 25 °C, pH 7,4 og en ionestyrke på 0,15 M.

Referanseverdiene for albumin er $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL og $T_m = 63°C$. Fosfatbuffer har en dielektrisitetskonstant på 76,0.

1. pH-ledd: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Forholdstall: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Ionestyrkeledd: ionestyrken (0,15 M) er lik referanseverdien, så forholdstallet er 1.
3. Temperaturledd: temperaturen (25 °C) er lik referanseverdien, så forholdstallet er 1.
4. Løsemiddelledd: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Kalkulatoren angir 492,12 mg/mL, som faller i kategorien «svært løselig».

Eksempel: lysozym i glyserol ved lav temperatur

Finn løseligheten til lysozym i en glyserolløsning ved 4 °C, pH 5,0 og en ionestyrke på 0,1 M. Dette er betingelser som ligner på kjølelagring av et enzym.

Referanseverdiene for lysozym er $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL og $T_m = 72°C$. Glyserol har en dielektrisitetskonstant på 42,5.

1. pH-ledd: endringen fra pH 7,0 til pH 5,0 (begge langt under pI på 11,35) endrer pH-leddet bare litt. Forholdstall: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Ionestyrkeledd: reduksjon av ionestyrken fra 0,15 M til 0,1 M øker løseligheten litt gjennom salting-in-effekten. Forholdstall: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperaturterm: avkjøling fra 25 °C til 4 °C, langt under smeltepunktet, reduserer termen. Forhold: 0,8106.
4. Løsemiddelledd: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Kalkulatoren angir 35,88 mg/mL, som faller i kategorien «løselig». Det er den lave dielektrisitetskonstanten til glyserol, ikke den lave temperaturen, som trekker resultatet ned fra referanseverdien.

Slik bruker du kalkulatoren for proteinløselighet

1. Velg et protein fra listen: albumin, insulin, lysozym, hemoglobin, myoglobin, kollagen, kasein eller fibrinogen.
2. Velg et løsemiddel: vann, fosfatbuffer, Tris-buffer, glyserol, DMSO, metanol, etanol eller aceton.
3. Angi temperaturen i °C (0 til 100), pH-en (0 til 14) og ionestyrken i molar (0 til 2).
4. Les av den beregnede løseligheten i mg/mL og kategorien. En søyle under resultatet viser verdien på en skala fra 0 til 100 mg/mL og fylles helt ved 100 mg/mL eller mer.

Hva påvirker proteinløselighet

pH og det isoelektriske punktet. Alle proteiner har et isoelektrisk punkt, pH-en der overflaten ikke har noen nettoladning. Ved denne pH-en frastøter proteinmolekylene ikke hverandre, slik at de klumper seg sammen og lettere faller ut av løsningen. Når pH-en flyttes bort fra det isoelektriske punktet i en av retningene, får proteinet en nettoladning. Ladde molekyler frastøter hverandre, noe som holder dem adskilt og oppløst.

Ionestyrke. Oppløste saltioner omgir et proteins ladde overflategrupper. Ved lave til moderate konsentrasjoner skjermer disse ionene ladninger som ellers ville tiltrukket to proteinmolekyler til hverandre, noe som øker løseligheten. Dette kalles salting in. Ved høye saltkonsentrasjoner konkurrerer ionene med proteinet om vannmolekyler og fjerner vannlaget som holder proteinet oppløst. Dette kalles salting out og danner grunnlaget for en vanlig rensemetode der ammoniumsulfat brukes til å felle ut proteiner fra en blanding.

Temperatur. Oppvarming av en løsning øker vanligvis løseligheten, opp til et visst punkt. Når temperaturen nærmer seg proteinets denatureringstemperatur, begynner proteinet å denaturere. Når proteinet folder seg ut, blir hydrofobe (vannavstøtende) deler av proteinet, som vanligvis er skjult inne i den foldede strukturen, eksponert. Disse eksponerte delene fester seg til hverandre og forårsaker aggregering, slik at løseligheten faller brått nær og over denatureringstemperaturen.

Løsemiddel. Dielektrisitetskonstanten til et løsemiddel måler hvor effektivt det svekker den elektriske tiltrekningen mellom ladde partikler. Vann har høy dielektrisitetskonstant og separerer ladninger godt, og derfor løses de fleste proteiner bedre i vann enn i organiske løsemidler som etanol eller aceton. Løsemidler med lav dielektrisitetskonstant lar motsatt ladede grupper på ulike proteinmolekyler tiltrekke hverandre sterkere, noe som fremmer aggregering.

Begrensninger

Kalkulatoren bruker en forenklet modell basert på et lite utvalg referanseproteiner og standardløsemidler. Den tar ikke hensyn til proteinets renhet, tilsetningsstoffer som detergenter eller stabilisatorer, eller uvanlige bufferkomponenter. Resultatene er anslag for planlegging av eksperimenter, ikke en erstatning for direkte måling av løselighet i laboratoriet.

Ofte stilte spørsmål

Hva er proteinløselighet? Proteinløselighet er den høyeste konsentrasjonen av et protein som forblir fullstendig oppløst i et løsemiddel uten å danne synlige aggregater eller utfelling.

Hvorfor er et protein minst løselig ved sitt isoelektriske punkt? Ved det isoelektriske punktet har proteinet ingen nettoladning, slik at proteinmolekylene ikke lenger frastøter hverandre elektrisk. Uten denne frastøtningen er det mer sannsynlig at de fester seg til hverandre og faller ut av løsningen.

Hva er forskjellen mellom salting in og salting out? Salting in skjer ved lave saltkonsentrasjoner, der oppløste ioner skjermer proteinets ladde grupper fra hverandre og øker løseligheten. Salting out skjer ved høye saltkonsentrasjoner, der ionene trekker vann bort fra proteinets overflate og reduserer løseligheten.

Øker høyere temperatur alltid løseligheten? Nei. Løseligheten har en tendens til å øke med temperaturen bare opp til et visst punkt. Når temperaturen nærmer seg proteinets denatureringstemperatur, begynner proteinet å denaturere, noe som vanligvis fører til aggregering og et brått fall i løselighet.

Hvorfor løses proteiner dårligere i etanol eller aceton enn i vann? Vann har høy dielektrisitetskonstant, noe som betyr at det svekker den elektriske tiltrekningen mellom ladde deler av proteinmolekyler svært effektivt. Etanol og aceton har lavere dielektrisitetskonstanter, så ladde grupper på ulike proteinmolekyler tiltrekker hverandre sterkere i disse løsemidlene, noe som gjør aggregering mer sannsynlig.

Hvor nøyaktig er denne kalkulatoren? Den gir et anslag basert på en fysisk modell og et lite utvalg referanseproteiner og løsemidler. Den er nyttig for å begrense hvilke betingelser som bør testes, men eksperimentell måling er fortsatt den eneste måten å bekrefte løseligheten til en bestemt proteinprøve på.

Videre lesning

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.