Oblicz dokładne objętości próbek na podstawie odczytów absorbancji testu BCA i pożądanej masy białka. Niezbędne do spójnego ładowania białka w western blotach i innych zastosowaniach laboratoryjnych.
To narzędzie oblicza wymaganą objętość próbki na podstawie wyników absorbancji BCA i masy próbki. Wprowadź wartość absorbancji i masę próbki dla każdej próbki, aby obliczyć odpowiadającą objętość próbki.
Objętość próbki oblicza się za pomocą następującego wzoru:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Kalkulator objętości próbki BCA Absorbancji to specjalistyczne narzędzie zaprojektowane, aby pomóc badaczom i technikom laboratoryjnym dokładnie określić odpowiednią objętość próbki do eksperymentów na podstawie wyników testu BCA (kwas bicinchonowy). Ten kalkulator przyjmuje odczyty absorbancji z twojego testu BCA oraz pożądaną masę próbki, aby obliczyć precyzyjną objętość potrzebną do spójnego ładowania białka w aplikacjach takich jak western blotting, testy enzymatyczne i inne techniki analizy białek.
Test BCA jest jedną z najczęściej stosowanych metod do ilościowego oznaczania białek w laboratoriach biochemicznych i biologii molekularnej. Mierząc absorbancję próbek białkowych i porównując je z krzywą standardową, można określić stężenie białka z wysoką dokładnością. Nasz kalkulator upraszcza ten proces, automatycznie przekształcając odczyty absorbancji w dokładne objętości próbek wymagane do twoich eksperymentów.
Test kwasu bicinchonowego (BCA) to biochemiczna metoda do określania całkowitego stężenia białka w roztworze. Zasada tego testu opiera się na tworzeniu kompleksu Cu²⁺-białko w warunkach alkalicznych, a następnie redukcji Cu²⁺ do Cu¹⁺. Ilość redukcji jest proporcjonalna do obecności białka. BCA tworzy fioletowy kompleks z Cu¹⁺ w środowisku alkalicznym, co stanowi podstawę do monitorowania redukcji miedzi przez białka.
Intensywność fioletowego koloru wzrasta proporcjonalnie do stężenia białka, co można zmierzyć za pomocą spektrofotometru przy około 562 nm. Odczyty absorbancji są następnie porównywane z krzywą standardową, aby określić stężenie białka w nieznanych próbkach.
Podstawowy wzór do obliczania objętości próbki na podstawie wyników absorbancji BCA to:
Gdzie:
Stężenie białka oblicza się z odczytu absorbancji przy użyciu równania krzywej standardowej:
Dla standardowego testu BCA typowe nachylenie wynosi około 2,0, a przecięcie często jest bliskie zeru, chociaż wartości te mogą się różnić w zależności od specyficznych warunków testu i krzywej standardowej.
Nasz kalkulator upraszcza proces określania objętości próbek na podstawie wyników testu BCA. Wykonaj następujące kroki, aby uzyskać dokładne obliczenia:
Wprowadź informacje o próbce:
Wybierz typ krzywej standardowej:
Zobacz wyniki:
Skopiuj lub eksportuj wyniki:
Przejdźmy przez praktyczny przykład:
To oznacza, że powinieneś załadować 13,33 μL swojej próbki, aby uzyskać 20 μg białka.
Kalkulator dostarcza kilku ważnych informacji:
Stężenie białka: To jest obliczane na podstawie twojego odczytu absorbancji przy użyciu wybranej krzywej standardowej. Reprezentuje ilość białka na jednostkę objętości w twojej próbce (μg/μL).
Objętość próbki: To objętość twojej próbki, która zawiera pożądaną ilość białka. Ta wartość jest tym, co użyjesz podczas przygotowywania swoich eksperymentów.
Ostrzeżenia i zalecenia: Kalkulator może dostarczać ostrzeżenia dla:
Jednym z najczęstszych zastosowań tego kalkulatora jest przygotowanie próbek do western blotting. Spójne ładowanie białka jest kluczowe dla wiarygodnych wyników western blot, a ten kalkulator zapewnia, że ładujesz tę samą ilość białka dla każdej próbki, nawet gdy ich stężenia różnią się.
Przykład przepływu pracy:
W przypadku testów enzymatycznych często konieczne jest użycie określonej ilości białka, aby ustandaryzować warunki reakcji w różnych próbkach lub eksperymentach.
Przykład przepływu pracy:
W eksperymentach immunoprecypitacyjnych ważne jest, aby zacząć od spójnej ilości białka, aby porównać wyniki w różnych warunkach.
Przykład przepływu pracy:
Podczas oczyszczania białek często konieczne jest śledzenie stężenia białka i obliczanie wydajności na różnych etapach.
Przykład przepływu pracy:
Chociaż kalkulator dostarcza domyślne parametry dla standardowych testów BCA, możesz również wprowadzić niestandardowe wartości, jeśli wygenerowałeś własną krzywą standardową. Jest to szczególnie przydatne, gdy:
Aby użyć niestandardowej krzywej standardowej:
Kalkulator pozwala na dodanie wielu próbek i jednoczesne obliczenie ich objętości. Jest to szczególnie przydatne podczas przygotowywania próbek do eksperymentów, które wymagają spójnego ładowania białka w różnych warunkach.
Zalety przetwarzania wsadowego:
Jeśli twój odczyt absorbancji jest powyżej 2,0, może to być poza liniowym zakresem testu BCA. W takich przypadkach:
Dla odczytów absorbancji poniżej 0,1 możesz być blisko limitu detekcji testu, co może wpłynąć na dokładność. Rozważ:
Jeśli kalkulator sugeruje objętość, która jest zbyt duża dla twojej aplikacji:
Dokładne ilościowe oznaczanie białek było fundamentalnym wymaganiem w biochemii i biologii molekularnej od momentu powstania tych dziedzin. Wczesne metody opierały się na oznaczaniu zawartości azotu, co było czasochłonne i wymagało specjalistycznego sprzętu.
Metoda Kjeldahla (1883): Jedna z najwcześniejszych metod ilościowego oznaczania białka, oparta na pomiarze zawartości azotu.
Test Biuretu (początek XX wieku): Metoda ta opiera się na reakcji między wiązaniami peptydowymi a jonami miedzi w roztworze alkalicznym, produkując fioletowy kolor.
Test Lowry'ego (1951): Opracowany przez Olivera Lowry'ego, ta metoda łączyła reakcję biuretu z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, zwiększając czułość.
Test Bradforda (1976): Marion Bradford opracowała tę metodę, używając barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250, który wiąże się z białkami i przesuwa maksimum absorpcji.
Test BCA (1985): Opracowany przez Paula Smitha i współpracowników w firmie Pierce Chemical Company, ta metoda łączyła reakcję biuretu z detekcją BCA, oferując poprawioną czułość i kompatybilność z detergentami.
Test BCA został po raz pierwszy opisany w artykule z 1985 roku autorstwa Smitha i in. zatytułowanym "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Został opracowany w celu rozwiązania ograniczeń istniejących metod, szczególnie zakłóceń ze strony różnych chemikaliów powszechnie stosowanych w ekstrakcji i oczyszczaniu białek.
Kluczową innowacją było użycie kwasu bicinchonowego do detekcji jonów Cu¹⁺ produkowanych przez białko podczas redukcji Cu²⁺, tworząc fioletowy kompleks, który można zmierzyć spektrofotometrycznie. To zapewniło kilka zalet:
Od momentu wprowadzenia test BCA stał się jedną z najczęściej stosowanych metod ilościowego oznaczania białek w laboratoriach biochemicznych i biologii molekularnej na całym świecie.
1=IF(B2<=0,"Błąd: Nieprawidłowa absorbancja",IF(C2<=0,"Błąd: Nieprawidłowa masa próbki",C2/(2*B2)))
2
3' Gdzie:
4' B2 zawiera odczyt absorbancji
5' C2 zawiera pożądaną masę próbki w μg
6' Formuła zwraca wymaganą objętość próbki w μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Oblicz stężenie białka z absorbancji przy użyciu krzywej standardowej."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbancja nie może być ujemna")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Oblicz wymaganą objętość próbki na podstawie absorbancji i pożądanej masy."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Masa próbki musi być dodatnia")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Obliczone stężenie białka musi być dodatnie")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Przykład użycia
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Dla absorbancji {absorbance} i pożądanej masy białka {sample_mass} μg:")
31 print(f"Stężenie białka: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Wymagana objętość próbki: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Błąd: {e}")
351# Funkcja do obliczania stężenia białka z absorbancji
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbancja nie może być ujemna")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcja do obliczania objętości próbki
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Masa próbki musi być dodatnia")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Obliczone stężenie białka musi być dodatnie")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Przykład użycia
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Dla absorbancji %.2f i pożądanej masy białka %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Stężenie białka: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Wymagana objętość próbki: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Błąd: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbancja nie może być ujemna");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Masa próbki musi być dodatnia");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Obliczone stężenie białka musi być dodatnie");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Przykład użycia
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Dla absorbancji ${absorbance} i pożądanej masy białka ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Stężenie białka: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Wymagana objętość próbki: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Błąd: ${error.message}`);
37}
38Związek między absorbancją a stężeniem białka jest zazwyczaj liniowy w pewnym zakresie. Poniżej znajduje się wizualizacja krzywej standardowej BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Różne metody ilościowego oznaczania białek mają różne zalety i ograniczenia. Oto jak test BCA porównuje się z innymi powszechnymi metodami:
| Metoda | Zakres czułości | Zalety | Ograniczenia | Najlepsze do |
|---|---|---|---|---|
| Test BCA | 5-2000 μg/mL | • Kompatybilny z detergentami • Mniejsza zmienność białko-białko • Stabilny rozwój koloru | • Zakłócony przez środki redukujące • Wpływ niektórych substancji chelatujących | • Ogólne ilościowe oznaczanie białka • Próbki zawierające detergenty |
| Test Bradforda | 1-1500 μg/mL | • Szybki (2-5 min) • Niewiele substancji zakłócających | • Wysoka zmienność białko-białko • Niekompatybilny z detergentami | • Szybkie pomiary • Próbki wolne od detergentów |
| Metoda Lowry'ego | 1-1500 μg/mL | • Dobrze ugruntowana • Dobra czułość | • Wiele substancji zakłócających • Wiele kroków | • Historyczna spójność • Czyste próbki białkowe |
| Absorbancja UV (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Niezniszczalna • Bardzo szybka • Nie wymaga odczynników | • Wpływ na kwasy nukleinowe • Wymaga czystych próbek | • Czyste roztwory białkowe • Szybkie kontrole podczas oczyszczania |
| Fluorometryczna | 0.1-500 μg/mL | • Najwyższa czułość • Szeroki zakres dynamiczny | • Drogie odczynniki • Wymaga fluorometru | • Bardzo rozcieńczone próbki • Ograniczona objętość próbki |
Test BCA (kwasu bicinchonowego) jest głównie używany do ilościowego oznaczania całkowitego stężenia białka w próbce. Jest szeroko stosowany w biochemii, biologii komórkowej i biologii molekularnej do aplikacji takich jak western blotting, testy enzymatyczne, immunoprecypitacja i oczyszczanie białek.
Test BCA jest zazwyczaj dokładny w granicach 5-10% przy prawidłowym wykonaniu. Jego dokładność zależy od kilku czynników, w tym jakości krzywej standardowej, braku substancji zakłócających oraz tego, czy skład nieznanego białka jest podobny do białka standardowego używanego.
Kilka substancji może zakłócać wyniki testu BCA, w tym:
Główne różnice to:
Jeśli twój kalkulator pokazuje bardzo dużą objętość próbki, zazwyczaj wskazuje to na niskie stężenie białka w próbce. Może to być spowodowane:
Rozważ skoncentrowanie próbki lub dostosowanie projektu eksperymentu do niższej zawartości białka.
Ten kalkulator został specjalnie zaprojektowany dla wyników testu BCA. Chociaż podstawowa zasada (przekształcanie stężenia w objętość) ma zastosowanie do innych metod, związek między absorbancją a stężeniem białka różni się między różnymi testami. Dla innych metod, takich jak Bradford czy Lowry, musisz użyć różnych parametrów krzywej standardowej.
Dla odczytów absorbancji poza zakresem liniowym (zwykle >2.0):
Białko surowicy bydlęcej (BSA) jest najczęściej używanym standardem w testach BCA, ponieważ jest:
Jednak jeśli twoje próbki zawierają dominujące białko, które znacznie różni się od BSA, rozważ użycie tego białka jako swojego standardu dla dokładniejszych wyników.
Fioletowy kolor rozwinięty w reakcji BCA jest stabilny przez kilka godzin w temperaturze pokojowej i można go zmierzyć w dowolnym momencie w tym okresie. Jednak dla najlepszych wyników zaleca się pomiar wszystkich standardów i próbek w przybliżeniu w tym samym czasie po rozwoju koloru.
Chociaż technicznie możliwe jest ponowne użycie krzywej standardowej, nie jest to zalecane dla dokładnego ilościowego oznaczania. Różnice w odczynnikach, warunkach inkubacji i kalibracji instrumentów mogą wpłynąć na związek między absorbancją a stężeniem białka. Dla wiarygodnych wyników zaleca się generowanie świeżej krzywej standardowej za każdym razem, gdy wykonujesz test.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, i in. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instrukcje. Dostępne pod adresem: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." W: Walker JM, red. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Teraz, gdy rozumiesz zasady dotyczące ilościowego oznaczania białek BCA i obliczania objętości próbki, wypróbuj nasz kalkulator, aby uprościć swój przepływ pracy w laboratorium. Po prostu wprowadź swoje odczyty absorbancji i pożądaną masę próbki, aby uzyskać natychmiastowe, dokładne obliczenia objętości próbki.
Niezależnie od tego, czy przygotowujesz próbki do western blotting, testów enzymatycznych czy jakiegokolwiek innego eksperymentu opartego na białkach, nasz kalkulator pomoże zapewnić spójne i wiarygodne wyniki. Oszczędzaj czas, zmniejszaj błędy i poprawiaj powtarzalność swoich eksperymentów za pomocą kalkulatora objętości próbki BCA Absorbancji.
Odkryj więcej narzędzi, które mogą być przydatne dla Twojego przepływu pracy