Calculadora de Concentração de Proteínas | A280 para mg/mL

Calculadora de concentração de proteína

Uma calculadora de concentração de proteína converte uma leitura de absorbância de luz, feita em um espectrofotômetro, na quantidade de proteína dissolvida em uma solução. O resultado costuma ser dado em miligramas por mililitro (mg/mL) ou microgramas por mililitro (μg/mL). O cálculo se baseia na lei de Beer-Lambert, uma relação da química que liga a quantidade de luz absorvida por uma amostra à quantidade de uma substância que ela contém.

Como a concentração de proteína é medida

A maioria das proteínas absorve fortemente a luz ultravioleta no comprimento de onda de 280 nanômetros (nm). Essa absorção vem principalmente de dois aminoácidos, o triptofano e a tirosina, presentes na estrutura da proteína. Um espectrofotômetro faz passar luz pela amostra e mede quanto dela a amostra absorve. Essa leitura é chamada de absorbância, ou A280 quando feita a 280 nm.

Medir a absorbância a 280 nm é rápido e não destrói a amostra. Isso a diferencia de métodos químicos como os ensaios de Bradford ou BCA, descritos adiante. O método funciona melhor com uma proteína purificada em solução, com leitura de absorbância entre cerca de 0,1 e 1,0. Leituras fora dessa faixa são menos confiáveis, por isso a amostra muitas vezes precisa ser diluída antes da medição.

Fórmula da concentração de proteína

A calculadora reorganiza a lei de Beer-Lambert para obter a concentração:

C = (A × FD) / (ε × l)

• C — concentração de proteína, em mg/mL
• A — absorbância a 280 nm (um número simples, sem unidade)
• FD — fator de diluição, quantas vezes a amostra original foi diluída antes de ser medida
• ε — coeficiente de extinção, uma constante específica da proteína, em L/(g·cm)
• l — caminho óptico, a distância que a luz percorre na amostra, em cm (geralmente 1 cm em uma cubeta padrão, um pequeno recipiente de vidro ou plástico usado no espectrofotômetro)

Para converter o resultado em microgramas por mililitro, multiplique o valor em mg/mL por 1.000. Para obter a massa total de proteína na amostra, multiplique a concentração pelo volume da amostra em mililitros.

Exemplo de cálculo

Uma amostra apresenta absorbância de 0,5 a 280 nm. Ela não foi diluída, portanto o fator de diluição é 1, e foi medida em uma cubeta padrão de 1 cm. A proteína é a albumina sérica bovina (BSA), cujo coeficiente de extinção é 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Em uma amostra de 1 mL, isso corresponde a cerca de 0,75 mg de proteína total, ou 750 μg/mL.

Coeficientes de extinção de proteínas comuns

Cada proteína absorve a luz de modo diferente, porque cada uma tem um número diferente de resíduos de triptofano e tirosina. O coeficiente de extinção descreve isso para uma proteína específica a 280 nm, em unidades de L/(g·cm). Os valores mais usados incluem:

Uma calculadora também pode aceitar um coeficiente de extinção personalizado para uma proteína que não consta desta lista. Para uma proteína de sequência de aminoácidos conhecida, esse valor pode ser estimado somando a absorbância dos resíduos de triptofano, tirosina e cistina, método publicado por Gill e von Hippel em 1989. O ProtParam o aplica com coeficientes medidos por Pace e colaboradores em 1995: ε₂₈₀ = (resíduos de triptofano × 5.500) + (resíduos de tirosina × 1.490) + (resíduos de cistina × 125). Essa fórmula dá um resultado em M⁻¹cm⁻¹, uma unidade molar, que difere dos valores em L/(g·cm), baseados em massa, apresentados acima. Ferramentas gratuitas como o ProtParam, hospedado no servidor ExPASy, calculam esse valor diretamente a partir de uma sequência de proteína.

Caminho óptico e fator de diluição

O caminho óptico é a largura da cubeta que contém a amostra, medida em centímetros. As cubetas padrão têm 1 cm de largura. Os espectrofotômetros de microvolume, que medem amostras muito pequenas, podem usar um caminho muito mais curto, como 0,1 cm.

O fator de diluição leva em conta qualquer diluição feita antes da medição. Se uma amostra concentrada der absorbância acima de 1,0, é comum diluí-la antes com tampão. O fator de diluição é igual ao volume total diluído dividido pelo volume original da amostra. Por exemplo, misturar 10 μL de amostra com 990 μL de tampão dá um volume total de 1.000 μL, um fator de diluição de 100.

Outras formas de medir a concentração de proteína

A absorbância a 280 nm é um dos vários métodos comuns usados em laboratório.

• Ensaio de Bradford: usa um corante que muda de cor ao se ligar à proteína. Funciona bem com amostras não purificadas, mas a mudança de cor pode variar entre proteínas diferentes.
• Ensaio de BCA: baseia-se em uma mudança de cor causada pelas ligações peptídicas da proteína. É compatível com muitos detergentes, mas leva mais tempo do que uma leitura direta de absorbância.
• Método de Lowry: um método mais antigo, muito sensível, mas que reage mal com alguns ingredientes comuns de tampões.

Cada um desses três métodos destrói a amostra. Uma medição direta de A280 não destrói, portanto a mesma amostra pode ser recuperada e usada novamente.

Perguntas frequentes

Qual é a faixa ideal de absorbância para este método?

Entre 0,1 e 1,0. Abaixo de 0,1, a leitura é imprecisa. Acima de 1,0, a relação entre absorbância e concentração pode deixar de ser linear, por isso a amostra deve ser diluída antes.

Por que medir a 280 nm em vez de 260 nm?

Os ácidos nucleicos, como o DNA e o RNA, absorvem fortemente a 260 nm. As proteínas absorvem mais a 280 nm por causa do seu teor de triptofano e tirosina. Medir a 280 nm reduz a interferência de eventuais ácidos nucleicos presentes na amostra.

Como obter o coeficiente de extinção de uma proteína que não consta da lista?

Para uma proteína de sequência conhecida, uma ferramenta como o ProtParam o calcula a partir do número de resíduos de triptofano, tirosina e cistina. Ele também pode ser medido diretamente, comparando a absorbância da amostra com a de uma solução de concentração conhecida.

Este método funciona para uma mistura de proteínas?

Funciona melhor para uma única proteína purificada com coeficiente de extinção conhecido. Uma mistura de proteínas desconhecidas, como um lisado celular, costuma ser medida com o ensaio de Bradford ou de BCA, pois esses métodos dão uma estimativa mais consistente da proteína total.

Os detergentes podem interferir na leitura?

Sim. Muitos detergentes absorvem luz perto de 280 nm, o que pode distorcer o resultado. Usar uma amostra em branco com a mesma concentração de detergente ajuda a cancelar essa absorbância de fundo. Concentrações muito altas de detergente podem exigir um ensaio compatível com detergentes, como o BCA.

Referências

1. SIB Swiss Institute of Bioinformatics, ExPASy. ProtParam documentation. Documentação do ProtParam — coeficiente de extinção a 280 nm em água, a partir de Ext(Tyr) = 1490, Ext(Trp) = 5500 e Ext(Cistina) = 125; método de Gill e von Hippel (1989), coeficientes de Pace et al. (1995).