Calculadora de Concentração de Proteínas | A280 para mg/mL

Calculadora de concentração de proteínas

Uma calculadora de concentração de proteínas converte uma leitura de absorbância de luz feita por um espectrofotômetro na quantidade de proteína dissolvida em uma solução. O resultado geralmente é apresentado em miligramas por mililitro (mg/mL) ou microgramas por mililitro (μg/mL). O cálculo baseia-se na lei de Beer-Lambert, uma relação da química que associa a quantidade de luz absorvida por uma amostra à quantidade de uma substância presente nela.

Como a concentração de proteínas é medida

A maioria das proteínas absorve fortemente a luz ultravioleta em um comprimento de onda de 280 nanômetros (nm). Essa absorção vem principalmente de dois aminoácidos, o triptofano e a tirosina, encontrados na estrutura da proteína. Um espectrofotômetro faz a luz atravessar a amostra e mede quanto dela é absorvido pela amostra. Essa leitura é chamada de absorbância, ou A280 quando é feita a 280 nm.

Medir a absorbância a 280 nm é rápido e não destrói a amostra. Isso diferencia o método de métodos químicos, como os ensaios de Bradford ou BCA, descritos abaixo. O método funciona melhor com uma proteína purificada em solução, com uma leitura de absorbância entre aproximadamente 0,1 e 1,0. Leituras fora desse intervalo são menos confiáveis, portanto muitas vezes é necessário diluir a amostra antes da medição.

Fórmula da concentração de proteínas

A calculadora reorganiza a lei de Beer-Lambert para obter a concentração:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — concentração de proteínas, em mg/mL
• A — absorbância a 280 nm (um número simples, sem unidade)
• DF — fator de diluição, quantas vezes a amostra original foi diluída antes da medição
• ε — coeficiente de extinção, uma constante específica da proteína, em L/(g·cm)
• l — comprimento do caminho óptico, a distância percorrida pela luz através da amostra, em cm (geralmente 1 cm em uma cubeta padrão, um pequeno recipiente de vidro ou plástico usado no espectrofotômetro)

Para converter o resultado em microgramas por mililitro, multiplique o valor em mg/mL por 1.000. Para encontrar a massa total de proteína na amostra, multiplique a concentração pelo volume da amostra em mililitros.

Exemplo de cálculo

Uma amostra apresenta uma leitura de absorbância de 0,5 a 280 nm. Ela não foi diluída, portanto o fator de diluição é 1, e foi medida em uma cubeta padrão de 1 cm. A proteína é a albumina sérica bovina (BSA), que tem um coeficiente de extinção de 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Em uma amostra de 1 mL, isso corresponde a aproximadamente 0,75 mg de proteína total, ou 750 μg/mL.

Coeficientes de extinção de proteínas comuns

Cada proteína absorve a luz de maneira diferente, pois cada uma tem um número distinto de resíduos de triptofano e tirosina. O coeficiente de extinção descreve essa característica para uma proteína específica a 280 nm, em unidades de L/(g·cm). Alguns valores usados com frequência são:

Uma calculadora também pode aceitar um coeficiente de extinção personalizado para uma proteína que não esteja nesta lista. Para uma proteína com sequência de aminoácidos conhecida, esse valor pode ser estimado com uma fórmula publicada por Gill e von Hippel em 1989: ε₂₈₀ = (resíduos de triptofano × 5,500) + (resíduos de tirosina × 1,490) + (resíduos de cistina × 125). Essa fórmula fornece um resultado em M⁻¹cm⁻¹, uma unidade molar, que é diferente dos valores baseados em massa, em L/(g·cm), apresentados acima. Ferramentas gratuitas, como o ProtParam, hospedado pelo servidor ExPASy, calculam esse valor diretamente a partir de uma sequência de proteína.

Comprimento do caminho óptico e fator de diluição

O comprimento do caminho óptico é a largura da cubeta que contém a amostra, medida em centímetros. As cubetas padrão têm 1 cm de largura. Espectrofotômetros de microvolume, que medem amostras muito pequenas, podem usar um caminho muito mais curto, como 0,1 cm.

O fator de diluição considera qualquer diluição realizada antes da medição. Se uma amostra concentrada apresentasse uma absorbância acima de 1,0, seria comum diluí-la primeiro com tampão. O fator de diluição é igual ao volume total diluído dividido pelo volume original da amostra. Por exemplo, misturar 10 μL de amostra com 990 μL de tampão produz um volume total de 1.000 μL e um fator de diluição de 100.

Outras formas de medir a concentração de proteínas

A absorbância a 280 nm é um dos vários métodos comuns usados em laboratório.

• Ensaio de Bradford: usa um corante que muda de cor quando se liga à proteína. Funciona bem com amostras não purificadas, mas a mudança de cor pode variar entre diferentes proteínas.
• Ensaio de BCA: baseia-se em uma mudança de cor causada pelas ligações peptídicas da proteína. É compatível com muitos detergentes, mas demora mais para ser realizado do que uma leitura direta de absorbância.
• Método de Lowry: um método mais antigo, muito sensível, mas que reage mal com alguns componentes comuns de tampões.

Cada um desses três métodos destrói a amostra. Uma medição direta de A280 não destrói a amostra, portanto a mesma amostra pode ser recuperada e usada novamente.

Perguntas frequentes

Qual é o intervalo ideal de absorbância para este método?

Entre 0,1 e 1,0. Abaixo de 0,1, a leitura é imprecisa. Acima de 1,0, a relação entre absorbância e concentração pode deixar de ser linear, portanto a amostra deve ser diluída primeiro.

Por que medir a 280 nm em vez de 260 nm?

Os ácidos nucleicos, como DNA e RNA, absorvem fortemente a 260 nm. As proteínas absorvem mais a 280 nm devido ao conteúdo de triptofano e tirosina. Medir a 280 nm reduz a interferência de quaisquer ácidos nucleicos presentes na amostra.

Como encontrar o coeficiente de extinção de uma proteína que não está na lista?

Para uma proteína com sequência conhecida, uma ferramenta como o ProtParam calcula o coeficiente a partir do número de resíduos de triptofano, tirosina e cistina. Ele também pode ser medido diretamente, comparando a absorbância da amostra com a de uma solução de concentração conhecida.

Este método funciona para uma mistura de proteínas?

Ele funciona melhor para uma única proteína purificada com coeficiente de extinção conhecido. Uma mistura de proteínas desconhecidas, como um lisado celular, geralmente é medida com o ensaio de Bradford ou BCA, pois esses métodos fornecem uma estimativa mais consistente da quantidade total de proteínas.

Os detergentes podem interferir na leitura?

Sim. Muitos detergentes absorvem luz perto de 280 nm, o que pode distorcer o resultado. Usar uma amostra em branco que contenha a mesma concentração de detergente ajuda a eliminar essa absorbância de fundo. Concentrações muito altas de detergente podem exigir um ensaio compatível com detergentes, como o BCA.