Calculadora de Concentração de DNA

Uma calculadora de concentração de DNA converte uma leitura de absorbância UV em 260 nanômetros, chamada A260, em concentração de DNA em nanogramas por microlitro (ng/µL). Ela também informa a quantidade total de DNA em uma amostra, em microgramas (µg).

O que é a absorbância A260?

A260 é a quantidade de luz ultravioleta que uma solução absorve em um comprimento de onda de 260 nanômetros. O DNA absorve luz UV com maior intensidade próximo a esse comprimento de onda por causa de suas bases nucleotídicas. Um espectrofotômetro mede A260 depois que uma leitura do branco, usando o mesmo tampão da amostra, remove a absorbância de fundo. Quanto mais DNA houver na solução, maior será a leitura de A260.

Fórmula da concentração de DNA

O DNA de fita dupla absorve luz ultravioleta em proporção à sua concentração, relação conhecida como lei de Beer-Lambert. Num caminho óptico padrão de 1 centímetro, uma solução com leitura de A260 igual a 1,0 contém cerca de 50 ng/µL de DNA de fita dupla. Esse número, o fator de conversão de 50 para DNA, transforma qualquer leitura de A260 em concentração:

Concentração de DNA (ng/µL) = A260 × 50 × fator de diluição

O fator de diluição leva em conta qualquer diluição feita antes da medição da amostra. Uma amostra medida sem diluição tem um fator de diluição de 1.

Como calcular o rendimento total de DNA

Depois que a concentração é conhecida, a massa total de DNA na amostra pode ser determinada a partir de seu volume:

DNA total (µg) = concentração (ng/µL) × volume (µL) ÷ 1000

Como calcular a concentração de DNA: passo a passo

Misture bem a amostra antes da medição. O DNA pode aderir às paredes do tubo ou sedimentar de maneira desigual.
Dilua a amostra se ela estiver muito concentrada, buscando uma leitura de A260 entre 0,1 e 1,0. As leituras do espectrofotômetro são menos confiáveis fora dessa faixa.
Faça o branco do espectrofotômetro com o mesmo tampão usado para a diluição e, em seguida, meça a amostra em 260 nm.
Informe a leitura de A260, o volume da amostra e o fator de diluição na calculadora para obter a concentração e o rendimento total.

Exemplos de cálculo

Exemplo 1: amostra não diluída

Uma leitura de A260 de 0,5, sem diluição (fator de diluição 1) e um volume de amostra de 100 µL.

Concentração = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
DNA total = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Exemplo 2: amostra diluída

Uma amostra de 50 µL foi diluída 10 vezes antes da medição, resultando numa leitura de A260 de 0,75.

Concentração = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
DNA total = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Calculando o fator de diluição

Fator de diluição = volume total após a diluição ÷ volume da amostra original.

Adicionar 5 µL de solução de DNA a 45 µL de tampão resulta em um volume total de 50 µL; portanto, o fator de diluição é 50 ÷ 5 = 10. Uma amostra que não foi diluída tem um fator de diluição de 1.

Faixas típicas de concentração de DNA

A concentração depende do tipo de amostra e do método de extração. Um resultado muito fora da faixa esperada para um dado método pode indicar um problema na extração ou na própria medição.

Limitações da medição por absorbância UV

Medir A260 é rápido, mas não é o método mais sensível ou específico para DNA. Proteínas, RNA e alguns componentes do tampão também absorvem luz próximo a 260 nm e podem aumentar a leitura. Os cientistas frequentemente verificam a razão A260/A280 junto com a concentração para detectar contaminação por proteínas; uma razão próxima de 1,8 geralmente indica uma amostra de DNA pura. Métodos baseados em corantes fluorescentes, como os ensaios Qubit, ligam-se apenas ao DNA de fita dupla e fornecem uma leitura mais precisa para amostras diluídas ou impuras, embora exijam reagentes adicionais e um fluorímetro.

Perguntas frequentes

Como calcular a concentração de DNA a partir de A260?

Multiplique a leitura de A260 por 50, o fator de conversão padrão para DNA de fita dupla, e depois multiplique pelo fator de diluição. Se a amostra não tiver sido diluída, use um fator de diluição de 1.

Qual é uma boa razão A260/A280?

Uma razão próxima de 1,8 geralmente indica uma amostra de DNA pura. Uma razão menor sugere contaminação por proteínas. Uma razão acima de 2,0 pode indicar contaminação por RNA.

Esta calculadora pode ser usada para RNA?

Não diretamente, porque o RNA usa um fator de conversão de 40 ng/µL em vez de 50. Para estimar a concentração de RNA, multiplique o resultado da calculadora por 0,8 (40 ÷ 50) ou use diretamente A260 × 40 × fator de diluição.

Por que a leitura de A260 deve ficar entre 0,1 e 1,0?

A absorbância permanece aproximadamente proporcional à concentração, conforme descrito pela lei de Beer-Lambert, principalmente dentro desse intervalo. Fora dele, as leituras se tornam menos confiáveis; portanto, uma amostra muito concentrada ou muito diluída deve ser diluída ou concentrada antes de ser medida novamente.

Qual é a diferença entre concentração e pureza?

A concentração mede a quantidade de DNA presente, em ng/µL. A pureza mede o grau de limpeza da amostra, avaliado principalmente por razões de absorbância como A260/A280. Uma amostra pode ter alta concentração e ainda ser impura, ou baixa concentração e ser muito pura.

Como converter ng/µL em µg/mL?

As duas unidades são numericamente iguais. 1 ng/µL equivale a 1 µg/mL, porque a unidade de massa e a unidade de volume são redimensionadas, cada uma, por um fator de 1000.

Referências

Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. Journal of Visualized Experiments. Texto completo no PubMed Central — constantes de concentração de 50 para DNA e 40 para RNA; razão A260/A280 de cerca de 1,8 para DNA puro; razões menores sugerem proteínas ou outros contaminantes.
Massachusetts Institute of Technology, OpenCourseWare. 7.13 Experimental Microbial Genetics: UV spectrophotometric measurement of DNA concentration and purity. Protocolo de espectrofotometria do MIT OCW — para uma medição exata, o valor de A260 deve estar entre 0,1 e 1.

Calculadora de Concentração de DNA | Conversor de A260 para ng/μL