Calculadora de Concentração de DNA

Uma calculadora de concentração de DNA converte uma leitura de absorbância UV em 260 nanômetros, chamada A260, em concentração de DNA em nanogramas por microlitro (ng/µL). Ela também informa a quantidade total de DNA em uma amostra, em microgramas (µg).

O que é a absorbância A260?

A260 é a quantidade de luz ultravioleta que uma solução absorve em um comprimento de onda de 260 nanômetros. O DNA absorve luz UV com maior intensidade próximo a esse comprimento de onda por causa de suas bases nucleotídicas. Um espectrofotômetro mede A260 depois que uma leitura do branco, usando o mesmo tampão da amostra, remove a absorbância de fundo. Quanto mais DNA houver na solução, maior será a leitura de A260.

Fórmula da concentração de DNA

O DNA de fita dupla absorve luz UV proporcionalmente à sua concentração, uma relação conhecida como lei de Beer-Lambert. Em um caminho óptico padrão de 1 centímetro, uma solução com uma leitura de A260 de 1,0 contém aproximadamente 50 ng/µL de DNA de fita dupla. Esse número, o fator de conversão, transforma qualquer leitura de A260 em uma concentração:

Concentração de DNA (ng/µL) = A260 × 50 × fator de diluição

O fator de diluição leva em conta qualquer diluição feita antes da medição da amostra. Uma amostra medida sem diluição tem um fator de diluição de 1.

Como calcular o rendimento total de DNA

Depois que a concentração é conhecida, a massa total de DNA na amostra pode ser determinada a partir de seu volume:

DNA total (µg) = concentração (ng/µL) × volume (µL) ÷ 1000

Como calcular a concentração de DNA: passo a passo

Misture bem a amostra antes da medição. O DNA pode aderir às paredes do tubo ou sedimentar de maneira desigual.
Dilua a amostra se ela estiver muito concentrada, buscando uma leitura de A260 entre 0,1 e 1,0. As leituras do espectrofotômetro são menos confiáveis fora desse intervalo.
Faça o branco do espectrofotômetro com o mesmo tampão usado para a diluição e, em seguida, meça a amostra em 260 nm.
Insira a leitura de A260, o volume da amostra e o fator de diluição na calculadora para obter a concentração e o rendimento total. As três caixas devem ser preenchidas, e o volume deve ser maior que zero, para que um resultado seja exibido.

Exemplo resolvido

Exemplo 1: amostra não diluída

Uma leitura de A260 de 0,5, sem diluição (fator de diluição 1) e um volume de amostra de 100 µL.

Concentração = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
DNA total = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Exemplo 2: amostra diluída

Um tubo contém 50 µL de DNA purificado. Uma pequena parte dele foi diluída 10 vezes, e a porção diluída apresentou uma leitura de A260 de 0,75. O fator de diluição converte essa leitura novamente na concentração do tubo original, e o volume de 50 µL é o valor inserido na etapa de cálculo do rendimento total.

Concentração = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
DNA total = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Calculando o fator de diluição

Fator de diluição = volume total após a diluição ÷ volume da amostra original.

Adicionar 5 µL de solução de DNA a 45 µL de tampão resulta em um volume total de 50 µL; portanto, o fator de diluição é 50 ÷ 5 = 10. Uma amostra que não foi diluída tem um fator de diluição de 1.

Faixas típicas de concentração de DNA

A concentração depende do tipo de amostra e do método de extração. As extrações de DNA genômico geralmente ficam entre aproximadamente 10 e 100 ng/µL. As preparações de DNA plasmidial frequentemente produzem concentrações mais altas, às vezes de várias centenas de ng/µL. Um resultado muito fora da faixa esperada para determinado método pode indicar um problema na extração ou na própria medição.

Limitações da medição por absorbância UV

Medir A260 é rápido, mas não é o método mais sensível ou específico para DNA. Proteínas, RNA e alguns componentes do tampão também absorvem luz próximo a 260 nm e podem aumentar a leitura. Os cientistas frequentemente verificam a razão A260/A280 junto com a concentração para detectar contaminação por proteínas; uma razão próxima de 1,8 geralmente indica uma amostra de DNA pura. Métodos baseados em corantes fluorescentes, como os ensaios Qubit, ligam-se apenas ao DNA de fita dupla e fornecem uma leitura mais precisa para amostras diluídas ou impuras, embora exijam reagentes adicionais e um fluorímetro.

Perguntas frequentes

Como calcular a concentração de DNA a partir de A260?

Multiplique a leitura de A260 por 50, o fator de conversão padrão para DNA de fita dupla, e depois multiplique pelo fator de diluição. Se a amostra não tiver sido diluída, use um fator de diluição de 1.

Qual é uma boa razão A260/A280?

Uma razão próxima de 1,8 geralmente indica uma amostra de DNA pura. Uma razão menor sugere contaminação por proteínas. Uma razão acima de 2,0 pode indicar contaminação por RNA.

Esta calculadora pode ser usada para RNA?

Não diretamente, porque o RNA usa um fator de conversão de 40 ng/µL em vez de 50. Para estimar a concentração de RNA, multiplique o resultado da calculadora por 0,8 (40 ÷ 50) ou use diretamente A260 × 40 × fator de diluição.

Por que a leitura de A260 deve ficar entre 0,1 e 1,0?

A absorbância permanece aproximadamente proporcional à concentração, conforme descrito pela lei de Beer-Lambert, principalmente dentro desse intervalo. Fora dele, as leituras se tornam menos confiáveis; portanto, uma amostra muito concentrada ou muito diluída deve ser diluída ou concentrada antes de ser medida novamente.

Qual é a diferença entre concentração e pureza?

A concentração mede a quantidade de DNA presente, em ng/µL. A pureza mede o grau de limpeza da amostra, avaliado principalmente por razões de absorbância como A260/A280. Uma amostra pode ter alta concentração e ainda ser impura, ou baixa concentração e ser muito pura.

Como converter ng/µL em µg/mL?

As duas unidades são numericamente iguais. 1 ng/µL equivale a 1 µg/mL, porque a unidade de massa e a unidade de volume são redimensionadas, cada uma, por um fator de 1000.

Referências

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.ª ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantificação de DNA e RNA por espectroscopia de absorção e fluorescência. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Valor das razões A260/A280 para a medição da pureza de ácidos nucleicos. BioTechniques, 19(2), 208–210.

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