Calculator de Diluție Celulară - Instrument Precis de Diluție de Laborator

Calculator pentru diluarea celulelor

Un calculator pentru diluarea celulelor determină câtă suspensie celulară și cât diluant trebuie amestecate pentru a ajunge la o concentrație celulară-țintă într-un volum final ales. Este utilizat în cultura celulară, microbiologie și alte activități de laborator în care o probă trebuie adusă la o concentrație exactă înainte de utilizare.

Ce înseamnă diluarea celulelor

Diluarea unei suspensii celulare nu schimbă numărul de celule pe care îl conține. Schimbă doar volumul în care se află celulele, ceea ce reduce concentrația. O suspensie numărată la 1.000.000 celule pe mililitru (celule/mL) conține în continuare același număr total de celule după diluare. Acest număr este pur și simplu distribuit într-o cantitate mai mare de lichid.

Laboratoarele diluează celulele înaintea multor etape de rutină: împărțirea unei culturi în creștere în flacoane noi, însămânțarea unui număr fix de celule în fiecare godeu al unei plăci, congelarea celulelor pentru depozitare sau pregătirea unei probe pentru un contor de celule ori un citometru în flux.

Formula diluării celulare

Calculul se bazează pe o singură regulă. Numărul de celule prelevate din suspensia stoc, înmulțit cu concentrația acesteia, trebuie să fie egal cu numărul de celule din volumul final, înmulțit cu concentrația-țintă:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — concentrația inițială (a stocului), în celule/mL
• V₁ — volumul de suspensie stoc utilizat, în mL
• C₂ — concentrația-țintă, în celule/mL
• V₂ — volumul final total necesar, în mL

Rezolvarea ecuației pentru V₁ oferă volumul de suspensie stoc care trebuie pipetat:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Restul volumului final este diluant, de obicei mediu de cultură celulară, soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) sau alt tampon:

Volumul diluantului = V₂ − V₁

Concentrația-țintă (C₂) nu poate fi niciodată mai mare decât concentrația stocului (C₁). Diluarea doar reduce concentrația. Pentru creșterea acesteia, celulele trebuie centrifugate și resuspendate într-o cantitate mai mică de lichid.

Cum se calculează o diluare celulară

1. Numărați suspensia stoc cu ajutorul unui hemocitometru sau al unui contor automat de celule pentru a obține C₁.
2. Notați concentrația-țintă, C₂, impusă de protocol.
3. Stabiliți volumul final total, V₂, necesar.
4. Calculați V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Calculați volumul diluantului ca V₂ − V₁.
6. Pipetați V₁ de suspensie stoc într-un tub, apoi adăugați volumul de mediu sau tampon necesar ca diluant.

Exemplu de calcul

O suspensie stoc este numărată la 1.000.000 celule/mL. Un protocol necesită 100.000 celule/mL într-un volum final de 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Volumul diluantului = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Prelevarea a 1 mL de suspensie stoc și adăugarea a 9 mL de mediu produc 10 mL de suspensie la 100.000 celule/mL.

Un al doilea exemplu

Un test pe o placă cu 96 de godeuri necesită 10.000 celule per godeu în 200 microlitri (μL) de mediu per godeu. Aceasta corespunde unei concentrații-țintă de 50.000 celule/mL, deoarece 10.000 celule împărțite la 0,2 mL dau 50.000 celule/mL. Stocul este numărat la 2.000.000 celule/mL, iar pentru acoperirea plăcii este necesar un volum total de 20 mL, cu o cantitate suplimentară pentru pierderile la pipetare.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Volumul diluantului = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Amestecarea a 0,5 mL de suspensie stoc cu 19,5 mL de mediu produce 20 mL la 50.000 celule/mL, o diluare de 1 la 40.

Surse de eroare

Formula în sine este exactă. Erorile provin din valorile introduse în ea.

• Eroare de numărare. Un număr greșit de celule duce direct la o diluare greșită. Numărarea tuturor celor patru pătrate de colț ale grilei hemocitometrului și calcularea mediei reduc acest risc.
• Celule aglomerate. O aglomerare de celule arată ca o singură celulă la microscop, dar este de fapt formată din mai multe celule, astfel că reduce concentrația aparentă.
• Intervalul pipetei. O pipetă utilizată în afara intervalului de volume pentru care este calibrată produce rezultate inexacte. O pipetă de 1000 μL setată să distribuie 5 μL nu este fiabilă; trebuie utilizată o pipetă mai mică.
• Confuzia unităților. Amestecarea celulelor/mL cu celule/μL produce o eroare de o mie de ori prea mare sau prea mică.
• Celule moarte. O numărare brută a celulelor include celulele moarte, cu excepția cazului în care s-a utilizat o colorare pentru viabilitate, cum ar fi albastrul de tripan. Astfel, se poate supraestima numărul de celule vii prezente efectiv.

Limitele acestui calculator

Calculatorul refuză valorile la care nu poate oferi un răspuns util:

• Fiecare valoare trebuie să fie mai mare decât zero.
• Concentrația-țintă nu poate fi mai mare decât concentrația inițială.
• Concentrația inițială trebuie să fie de cel mult 1 trilion de celule/mL (1 × 10¹²).
• Volumul stoc calculat trebuie să fie de cel puțin 0,001 mL, adică 1 microlitru. Orice valoare mai mică nu poate fi pipetată cu precizie, astfel că calculatorul solicită alte valori. Creșterea volumului total rezolvă de obicei problema.

Volumele sunt afișate cu două zecimale sau cu trei atunci când volumul stoc este mai mic de 0,01 mL, astfel încât un volum mic să nu apară ca 0,00 mL.

Întrebări frecvente

Care este formula pentru diluarea celulelor?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, unde C₁ și C₂ sunt concentrațiile inițială și țintă, iar V₁ și V₂ sunt volumul prelevat din stoc și volumul final total.

Poate concentrația-țintă să fie mai mare decât concentrația inițială?

Nu. Diluarea doar reduce concentrația. Pentru a obține o concentrație mai mare, celulele trebuie centrifugate și resuspendate într-un volum mai mic.

Ce lichid trebuie utilizat pentru diluarea celulelor?

Se utilizează mediu de cultură complet atunci când celulele trebuie să rămână sănătoase timp de ore sau zile, de exemplu înainte de însămânțarea unei plăci. PBS sau o soluție salină tamponată similară este potrivită pentru diluări scurte, de aproximativ 30 de minute, înainte ca celulele să fie prelucrate în continuare. Mediul fără ser este utilizat atunci când proteinele serice ar interfera cu o analiză ulterioară.

Funcționează această formulă pentru bacterii sau drojdii?

Da. C₁V₁ = C₂V₂ se aplică oricărei suspensii de particule, inclusiv bacteriilor măsurate în unități formatoare de colonii pe mililitru (UFC/mL), drojdiilor și particulelor virale măsurate în unități formatoare de plăci pe mililitru (UFP/mL), cu condiția să fie utilizate aceleași unități de ambele părți ale ecuației.

Trebuie numărate celulele moarte la diluare?

Pentru însămânțarea unei culturi vii trebuie numărate doar celulele viabile. Dacă o suspensie are o viabilitate de 80 %, concentrația viabilă este de 0,8 ori concentrația totală de celule, iar această concentrație viabilă trebuie utilizată ca C₁.

Cum pot fi realizate cu precizie diluările foarte mari?

Diluările mari, precum 1 la 1000, sunt de obicei realizate ca o serie de etape mai mici numite diluări în serie. Trei diluări succesive de 1 la 10 ajung în total la 1 la 1000, menținând fiecare etapă de pipetare în intervalul de volume care permite precizia.