Calculator Concentrație Proteică | A280 la mg/mL

Calculator pentru concentrația proteinelor

Un calculator pentru concentrația proteinelor transformă o citire a absorbției luminii de la un spectrofotometru în cantitatea de proteină dizolvată într-o soluție. Rezultatul este exprimat de obicei în miligrame pe mililitru (mg/mL) sau micrograme pe mililitru (μg/mL). Calculul se bazează pe legea Beer-Lambert, o relație din chimie care leagă cantitatea de lumină absorbită de probă de cantitatea unei substanțe pe care aceasta o conține.

Cum se măsoară concentrația proteinelor

Majoritatea proteinelor absorb puternic lumina ultravioletă la o lungime de undă de 280 nanometri (nm). Această absorbție provine în principal de la doi aminoacizi, triptofanul și tirozina, prezenți în structura proteinei. Un spectrofotometru trimite lumină prin probă și măsoară câtă lumină absoarbe aceasta. Citirea se numește absorbanță sau A280 atunci când este efectuată la 280 nm.

Măsurarea absorbanței la 280 nm este rapidă și nu distruge proba. Prin aceasta se deosebește de metodele chimice, precum testele Bradford sau BCA, descrise mai jos. Metoda funcționează cel mai bine pentru o proteină purificată în soluție, cu o absorbanță cuprinsă aproximativ între 0,1 și 1,0. Citirile din afara acestui interval sunt mai puțin fiabile, astfel că proba trebuie adesea diluată înainte de măsurare.

Formula concentrației proteinelor

Calculatorul rearanjează legea Beer-Lambert pentru a determina concentrația:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — concentrația proteinei, în mg/mL
• A — absorbanța la 280 nm (un număr simplu, fără unitate)
• DF — factorul de diluție, de câte ori a fost diluată proba inițială înainte de măsurare
• ε — coeficientul de extincție, o constantă specifică proteinei, în L/(g·cm)
• l — lungimea parcursului optic, distanța străbătută de lumină prin probă, în cm (de obicei 1 cm într-o cuvetă standard, un recipient mic din sticlă sau plastic utilizat în spectrofotometru)

Pentru a converti rezultatul în micrograme pe mililitru, înmulțiți valoarea în mg/mL cu 1.000. Pentru a determina masa totală a proteinei din probă, înmulțiți concentrația cu volumul probei în mililitri.

Exemplu de calcul

O probă are o absorbanță de 0,5 la 280 nm. Nu a fost diluată, astfel că factorul de diluție este 1, iar măsurarea a fost efectuată într-o cuvetă standard de 1 cm. Proteina este albumina serică bovină (BSA), care are un coeficient de extincție de 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Într-o probă de 1 mL, aceasta reprezintă aproximativ 0,75 mg de proteină totală sau 750 μg/mL.

Coeficienții de extincție pentru proteine comune

Fiecare proteină absoarbe lumina în mod diferit, deoarece conține un număr diferit de reziduuri de triptofan și tirozină. Coeficientul de extincție descrie acest aspect pentru o anumită proteină la 280 nm, în unități de L/(g·cm). Printre valorile utilizate frecvent se numără:

Calculatorul poate accepta și un coeficient de extincție personalizat pentru o proteină care nu se află pe această listă. Pentru o proteină a cărei secvență de aminoacizi este cunoscută, această valoare poate fi estimată cu o formulă publicată de Gill și von Hippel în 1989: ε₂₈₀ = (reziduuri de triptofan × 5.500) + (reziduuri de tirozină × 1.490) + (reziduuri de cistină × 125). Formula oferă un rezultat în M⁻¹cm⁻¹, o unitate molară, diferită de valorile L/(g·cm) bazate pe masă prezentate mai sus. Instrumente gratuite, precum ProtParam, găzduit de serverul ExPASy, calculează direct această valoare din secvența unei proteine.

Lungimea parcursului optic și factorul de diluție

Lungimea parcursului optic este lățimea cuvetei care conține proba, măsurată în centimetri. Cuvetele standard au o lățime de 1 cm. Spectrofotometrele cu microvolum, care măsoară probe foarte mici, pot utiliza o lungime a parcursului optic mult mai mică, de exemplu 0,1 cm.

Factorul de diluție ține cont de orice diluare efectuată înainte de măsurare. Dacă o probă concentrată ar avea o absorbanță mai mare de 1,0, este obișnuit ca aceasta să fie diluată mai întâi cu tampon. Factorul de diluție este egal cu volumul total diluat împărțit la volumul probei inițiale. De exemplu, amestecarea a 10 μL de probă cu 990 μL de tampon produce un volum total de 1.000 μL și un factor de diluție de 100.

Alte metode de măsurare a concentrației proteinelor

Absorbanța la 280 nm este una dintre metodele frecvent utilizate în laborator.

• Testul Bradford: utilizează un colorant care își schimbă culoarea atunci când se leagă de proteină. Funcționează bine pentru probe nepurificate, dar schimbarea culorii poate varia între proteine diferite.
• Testul BCA: se bazează pe o schimbare de culoare provocată de legăturile peptidice ale proteinei. Este compatibil cu mulți detergenți, dar necesită mai mult timp decât o citire directă a absorbanței.
• Metoda Lowry: o metodă mai veche, foarte sensibilă, dar care reacționează slab cu unele componente obișnuite ale tampoanelor.

Fiecare dintre aceste trei metode distruge proba. O măsurare directă A280 nu o distruge, astfel încât aceeași probă poate fi recuperată și utilizată din nou.

Întrebări frecvente

Care este intervalul ideal de absorbanță pentru această metodă?

Între 0,1 și 1,0. Sub 0,1, citirea este imprecisă. Peste 1,0, relația dintre absorbanță și concentrație poate să nu mai fie liniară, astfel că proba trebuie diluată mai întâi.

De ce se măsoară la 280 nm în loc de 260 nm?

Acizii nucleici, precum ADN-ul și ARN-ul, absorb puternic la 260 nm. Proteinele absorb mai mult la 280 nm datorită conținutului lor de triptofan și tirozină. Măsurarea la 280 nm reduce interferența acizilor nucleici prezenți în probă.

Cum se determină coeficientul de extincție pentru o proteină care nu este listată?

Pentru o proteină cu secvență cunoscută, un instrument precum ProtParam îl calculează pe baza numărului de reziduuri de triptofan, tirozină și cistină. Coeficientul poate fi măsurat și direct, comparând absorbanța probei cu cea a unei soluții cu concentrație cunoscută.

Funcționează această metodă pentru un amestec de proteine?

Funcționează cel mai bine pentru o singură proteină purificată, cu un coeficient de extincție cunoscut. Un amestec de proteine necunoscute, precum un liz at celular, este de obicei măsurat prin testul Bradford sau BCA, deoarece aceste metode oferă o estimare mai uniformă a cantității totale de proteine.

Pot interfera detergenții cu citirea?

Da. Mulți detergenți absorb lumina în apropierea valorii de 280 nm, ceea ce poate distorsiona rezultatul. Utilizarea unei probe martor care conține aceeași concentrație de detergent ajută la eliminarea acestei absorbanțe de fond. Concentrațiile foarte mari de detergent pot impune utilizarea unui test compatibil cu detergenții, precum BCA.