Calculator de Solubilitate Proteică - Instrument Gratuit pentru pH și Temperatură

Un calculator de solubilitate a proteinelor estimează concentrația maximă a unei proteine care rămâne dizolvată într-un solvent la un anumit pH, temperatură și tărie ionică. Acesta transformă elementele de bază ale chimiei într-o singură valoare, în miligrame de proteină per mililitru de solvent.

Solubilitatea proteinelor este importantă în biochimie, formularea medicamentelor și știința alimentelor. O proteină care nu rămâne dizolvată formează agregate sau precipitate, ceea ce poate compromite un experiment sau poate face imposibilă injectarea unui medicament.

Cum se calculează solubilitatea proteinelor

Solubilitatea depinde de cinci factori: punctul izoelectric al proteinei (pH-ul la care sarcina sa netă este zero), temperatura de topire a proteinei (temperatura la care începe să-și piardă structura), constanta dielectrică a solventului (o măsură a capacității sale de a separa particulele încărcate), pH-ul soluției și tăria ionică (o măsură a cantității de sare dizolvată).

Calculatorul pornește de la solubilitatea cunoscută în apă a fiecărei proteine în condiții de referință stabilite: 25 °C, pH 7,0 și o tărie ionică de 0,15 M (aproximativ nivelul de sare din sânge). Apoi înmulțește această valoare de referință cu patru rapoarte, câte unul pentru fiecare condiție modificată.

Formula solubilității proteinelor

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ este solubilitatea cunoscută a proteinei în apă în condițiile de referință, în mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, unde $pI$ este punctul izoelectric al proteinei. Solubilitatea este minimă la punctul izoelectric și crește pe măsură ce pH-ul se îndepărtează de acesta, stabilizându-se în intervalul a câtorva unități de pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, unde $I$ este tăria ionică, exprimată în moli per litru. La concentrații mici de sare, acest termen crește ușor solubilitatea (efect de salting-in). La concentrații mari de sare, acest termen reduce solubilitatea (efect de salting-out).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, unde $T_m$ este punctul de topire al proteinei, în °C. Solubilitatea crește treptat odată cu temperatura, apoi scade brusc când temperatura se apropie de $T_m$ și proteina începe să se desfășoare.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, unde $\varepsilon$ este constanta dielectrică a solventului. Apa are o constantă dielectrică de 78,4, astfel încât acest termen este egal cu 1 în apă. Solvenții care separă sarcinile mai puțin eficient decât apa, precum etanolul, reduc solubilitatea.

Valorile de referință utilizate de calculator

Categorii de solubilitate

Exemplu: albumină în tampon fosfat

Determinați solubilitatea albuminei în tampon fosfat la 25 °C, pH 7,4 și o tărie ionică de 0,15 M.

Valorile de referință ale albuminei sunt $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml și $T_m = 63°C$. Tamponul fosfat are o constantă dielectrică de 76,0.

1. Termenul pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Raport: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Termenul ionic: tăria ionică (0,15 M) este egală cu valoarea de referință, astfel încât raportul este 1.
3. Termenul de temperatură: temperatura (25 °C) este egală cu valoarea de referință, astfel încât raportul este 1.
4. Termenul solventului: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/ml}$

Calculatorul raportează 492,12 mg/ml, valoare care se încadrează în categoria „foarte solubilă”.

Exemplu: lizozim în glicerol la temperatură scăzută

Determinați solubilitatea lizozimului într-o soluție de glicerol la 4 °C, pH 5,0 și o tărie ionică de 0,1 M. Acestea sunt condiții similare depozitării la rece a unei enzime.

Valorile de referință ale lizozimului sunt $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/ml și $T_m = 72°C$. Glicerolul are o constantă dielectrică de 42,5.

1. Termenul pH: trecerea de la pH 7,0 la pH 5,0 (ambele mult sub pI-ul de 11,35) modifică doar ușor termenul pH. Raport: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Termenul ionic: reducerea tăriei ionice de la 0,15 M la 0,1 M crește ușor solubilitatea prin efectul de salting-in. Raport: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Termen de temperatură: răcirea de la 25 °C la 4 °C, cu mult sub punctul de topire, reduce termenul. Raport: 0,8106.
4. Termenul solventului: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/ml}$

Calculatorul raportează 35,88 mg/ml, valoare care se încadrează în categoria „solubilă”. Constanta dielectrică scăzută a glicerolului, nu temperatura scăzută, este cea care reduce rezultatul față de valoarea de referință.

Cum se utilizează calculatorul de solubilitate a proteinelor

1. Alegeți o proteină din listă: albumină, insulină, lizozim, hemoglobină, mioglobină, colagen, cazeină sau fibrinogen.
2. Alegeți un solvent: apă, tampon fosfat, tampon Tris, glicerol, DMSO, metanol, etanol sau acetonă.
3. Introduceți temperatura în °C (de la 0 la 100), pH-ul (de la 0 la 14) și tăria ionică în molar (de la 0 la 2).
4. Citiți solubilitatea calculată în mg/ml și categoria sa. O bară de sub rezultat afișează valoarea pe o scală de la 0 la 100 mg/ml și se umple complet la 100 mg/ml sau mai mult.

Ce afectează solubilitatea proteinelor

pH-ul și punctul izoelectric. Fiecare proteină are un punct izoelectric, pH-ul la care suprafața sa nu poartă nicio sarcină electrică netă. La acest pH, moleculele de proteină nu se resping între ele, astfel încât se aglomerează și ies mai ușor din soluție. Îndepărtarea pH-ului de punctul izoelectric, în oricare direcție, conferă proteinei o sarcină netă. Moleculele încărcate se resping între ele, ceea ce le menține separate și dizolvate.

Tăria ionică. Ionii de sare dizolvați înconjoară grupările încărcate de la suprafața proteinei. La concentrații mici până la moderate, acești ioni ecranează sarcinile care altfel ar atrage două molecule de proteină una către cealaltă, ceea ce crește solubilitatea. Acest fenomen se numește salting in. La concentrații mari de sare, ionii concurează cu proteina pentru moleculele de apă, îndepărtând stratul de apă care menține proteina dizolvată. Acest fenomen se numește salting out și reprezintă principiul unei metode obișnuite de purificare în care sulfatul de amoniu este utilizat pentru a precipita proteinele dintr-un amestec.

Temperatura. Încălzirea unei soluții crește în general solubilitatea, până la un anumit punct. Când temperatura se apropie de punctul de topire al unei proteine, aceasta începe să se denatureze. Denaturarea expune regiuni hidrofobe (care resping apa) ale proteinei, ascunse în mod normal în structura sa pliată. Aceste porțiuni expuse se lipesc unele de altele, provocând agregarea, astfel încât solubilitatea scade brusc în apropierea și la temperaturi peste punctul de topire.

Solventul. Constanta dielectrică a unui solvent măsoară cât de eficient slăbește atracția electrică dintre particulele încărcate. Apa are o constantă dielectrică mare și separă bine sarcinile, motiv pentru care majoritatea proteinelor se dizolvă mai bine în apă decât în solvenți organici precum etanolul sau acetona. Solvenții cu o constantă dielectrică scăzută permit sarcinilor opuse de pe molecule diferite de proteină să se atragă mai puternic, favorizând agregarea.

Limitări

Calculatorul utilizează un model simplificat, bazat pe un set restrâns de proteine de referință și solvenți standard. Acesta nu ține cont de puritatea proteinei, de aditivi precum detergenții sau stabilizatorii ori de componente neobișnuite ale tampoanelor. Rezultatele sunt estimări pentru planificarea experimentelor, nu un înlocuitor pentru măsurarea directă a solubilității în laborator.

Întrebări frecvente

Ce este solubilitatea proteinelor? Solubilitatea proteinelor este concentrația maximă a unei proteine care rămâne complet dizolvată într-un solvent, fără a forma agregate vizibile sau precipitat.

De ce este o proteină cel mai puțin solubilă la punctul său izoelectric? La punctul izoelectric, proteina nu are sarcină electrică netă, astfel încât moleculele de proteină nu se mai resping electric. Fără această respingere, ele sunt mai susceptibile să se lipească între ele și să iasă din soluție.

Care este diferența dintre salting-in și salting-out? Fenomenul de salting in are loc la concentrații mici de sare, când ionii dizolvați ecranează între ele grupările încărcate ale proteinei și cresc solubilitatea. Fenomenul de salting out are loc la concentrații mari de sare, când ionii îndepărtează apa de pe suprafața proteinei și reduc solubilitatea.

Temperatura mai ridicată crește întotdeauna solubilitatea? Nu. Solubilitatea tinde să crească odată cu temperatura doar până la un anumit punct. Când temperatura se apropie de punctul de topire al unei proteine, aceasta începe să se denatureze, ceea ce provoacă de obicei agregarea și o scădere bruscă a solubilității.

De ce se dizolvă proteinele mai puțin în etanol sau acetonă decât în apă? Apa are o constantă dielectrică mare, ceea ce înseamnă că slăbește foarte eficient atracția electrică dintre părțile încărcate ale moleculelor de proteină. Etanolul și acetona au constante dielectrice mai mici, astfel încât grupările încărcate de pe molecule diferite de proteină se atrag mai puternic în acești solvenți, favorizând agregarea.

Cât de precis este acest calculator? Acesta oferă o estimare bazată pe un model fizic și pe un set restrâns de proteine și solvenți de referință. Este util pentru restrângerea condițiilor care trebuie testate, dar măsurarea experimentală rămâne singura modalitate de a confirma solubilitatea unei probe specifice de proteină.

Lecturi suplimentare

• Arakawa, T. și Timasheff, S. N. (1984). Mecanismul solubilizării și precipitării prin sărare a proteinelor, induse de sărurile cationilor divalenți. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M. și Pace, C. N. (2008). Măsurarea și creșterea solubilității proteinelor. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J. și Edsall, J. T. (1943). Proteine, aminoacizi și peptide ca ioni și ioni dipolari. Reinhold Publishing.