Калькулятор активности фермента - Кинетика Михаэлиса-Ментен

Калькулятор активности ферментов

Калькулятор активности ферментов определяет, с какой скоростью фермент превращает субстрат в продукт; результат выражается как удельная активность в единицах на миллиграмм (U/mg). Он использует уравнение Михаэлиса—Ментен, стандартную модель ферментативной кинетики, вместе с количеством белка фермента в образце.

Ферменты — это белки, ускоряющие химические реакции в клетках и не расходующиеся в процессе. Учёные измеряют активность фермента, чтобы сравнивать разные партии, проверять, дал ли результат этап очистки, или оценивать влияние лекарственного препарата на скорость реакции фермента. Одной концентрации фермента недостаточно, чтобы понять, выполняет ли он свою функцию. Это показывает удельная активность.

Что вычисляет калькулятор

Инструмент принимает пять входных данных: концентрацию фермента, концентрацию субстрата, константу Михаэлиса (Km), максимальную скорость (Vmax) и время реакции. Время реакции записывается для справки, но не входит в формулу. Vmax уже является скоростью — количеством субстрата, превращаемого за минуту, поэтому время уже учтено. Повторное деление на время привело бы к его двойному учёту.

Калькулятор выдаёт одно число и один график:

• Удельная активность — в U/mg. Это скорость реакции, делённая на количество присутствующего белка фермента.
• График зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, показывающий участки кривой при низкой концентрации, в переходной области и при насыщении. На нём отмечена скорость при введённой концентрации субстрата.

Как рассчитать активность фермента

Уравнение Михаэлиса—Ментен

Леонор Михаэлис и Мауд Ментен опубликовали эту модель в 1913 году. Она описывает зависимость скорости реакции фермента от концентрации субстрата:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = скорость реакции, то есть скорость при данной концентрации субстрата
• $V_{max}$ = максимальная скорость, то есть скорость при полном насыщении фермента субстратом
• $[S]$ = концентрация субстрата
• $K_m$ = константа Михаэлиса: концентрация субстрата, при которой скорость равна половине Vmax

Формула удельной активности

Удельная активность — это скорость, делённая на количество присутствующего белка фермента; результат выражается в единицах на миллиграмм (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Здесь $A$ — удельная активность, а $[E]$ — концентрация фермента.

Одна единица ферментативной активности (U) — это количество фермента, превращающее 1 микромоль (µmol) субстрата за минуту. Это определение установил Международный союз биохимии и молекулярной биологии (IUBMB).

Размерности выглядят следующим образом. В уравнении Михаэлиса—Ментен скорость имеет размерность концентрации субстрата, делённой на время. Калькулятор принимает [S] и Km в мМ, поэтому Vmax и v выражаются в мкмоль в минуту на миллилитр, то есть в µmol/(min·mL). Это то же самое, что мМ/мин и U/mL. Концентрация фермента [E] выражается в мг/мл. При делении миллилитры сокращаются:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax уже включает «в минуту», поэтому отдельный член времени в формуле не нужен.

Этот расчёт предполагает, что измеренная скорость является начальной и измерена на ранней стадии реакции, пока субстрат не израсходован и продукт ещё не начал ингибировать фермент. В лабораториях обычно измеряют первые 5–10% превращения субстрата, чтобы оставаться в этом линейном диапазоне.

Пример расчёта

Пример 1. Концентрация фермента 1 мг/мл, концентрация субстрата 10 мМ, Km 5 мМ, Vmax 50 µmol/(min·mL). Это исходные значения калькулятора.

Скорость = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Удельная активность = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Пример 2. Те же условия, но концентрация фермента увеличена вдвое — до 2 мг/мл.

Скорость = 33,33 мкмоль/(мин·мл), не изменяется, поскольку в этом уравнении скорость не зависит от [E]. Удельная активность = 33,33 / 2 = 16,67 Ед./мг

Удвоение количества фермента снижает удельную активность вдвое, поскольку теперь та же общая скорость делится на вдвое большее количество белка.

Пример 3. Концентрация субстрата повышена до 100 мМ, что значительно выше Km; концентрация фермента составляет 1 мг/мл, Km — 5 мМ, Vmax — 50 µmol/(min·mL).

Скорость = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Удельная активность = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

При высокой концентрации субстрата фермент почти насыщен, поэтому скорость близка к Vmax.

Пример 4. Концентрация субстрата снижена до 1 мМ, что ниже Km; концентрация фермента составляет 1 мг/мл, Km — 5 мМ, Vmax — 50 µmol/(min·mL).

Скорость = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Удельная активность = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Ниже Km небольшое количество субстрата ограничивает реакцию, поэтому и скорость, и удельная активность значительно ниже Vmax.

Объяснение основных параметров

Концентрация фермента [E] — это масса белка фермента в единице объёма, выраженная в мг/мл. Более высокое значение означает, что та же скорость реакции распределяется между большим количеством белка, поэтому удельная активность снижается. Именно удельная активность, а не сама концентрация показывает, насколько хорошо работает ферментный препарат.

Концентрация субстрата [S] — это количество субстрата, доступного ферменту, обычно выражаемое в мМ. При низкой [S] небольшое увеличение резко повышает скорость. Вблизи насыщения дополнительный субстрат почти не влияет на неё.

Константа Михаэлиса (Km) — это концентрация субстрата, при которой скорость равна половине Vmax. Низкое Km означает, что фермент достигает половины максимальной скорости при низкой концентрации субстрата; это указывает на прочное связывание фермента с субстратом. Например, для глюкозы Km гексокиназы близка к 0,1 мМ, что свидетельствует о высоком сродстве.

Максимальная скорость (Vmax) — это скорость реакции, когда субстрат больше не является ограничивающим фактором. Вводите её в µmol/(min·mL), что эквивалентно мМ/мин или U/mL, чтобы единицы соответствовали мМ, используемым для [S] и Km. Она зависит от количества фермента и от того, насколько быстро каждая молекула фермента превращает субстрат (то есть от её каталитического числа, kcat).

Время реакции — это продолжительность проведения анализа. Оно помогает планировать эксперимент, поскольку слишком долгое протекание реакции может истощить субстрат и нарушить линейность. Само по себе время не входит в формулу удельной активности.

Интерпретация кривой скорости

На графике показана зависимость скорости от концентрации субстрата, рассчитанная по уравнению Михаэлиса—Ментен.

• Ниже Km: скорость примерно пропорциональна концентрации субстрата. Небольшие ошибки в концентрации субстрата приводят к большим ошибкам результата.
• Вблизи Km: кривая изгибается. Скорость равна половине Vmax.
• Выше Km: кривая выравнивается. Дополнительный субстрат почти не увеличивает скорость, поскольку фермент почти насыщен.

Зачем нужна удельная активность

Удельная активность — стандартный показатель чистоты и качества фермента. Во время очистки учёные отслеживают её на каждом этапе: неочищенный клеточный экстракт может иметь удельную активность в несколько U/mg, тогда как высокоочищенный образец может достигать сотен или тысяч U/mg. Рост удельной активности в ходе очистки показывает, что неактивный белок удаляется, а нужный фермент сохраняется.

Это же измерение используется при разработке лекарств, когда исследователи проверяют, как соединения-кандидаты снижают активность фермента, и в клинической диагностике, где врачи измеряют в крови такие ферменты, как ALT и AST, для выявления повреждения печени.

Часто задаваемые вопросы

Как рассчитать активность фермента по Km и Vmax? Сначала найдите скорость реакции по уравнению Михаэлиса—Ментен: v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Затем разделите скорость реакции на концентрацию фермента, чтобы получить удельную активность в Е/мг: Активность = v / [E]. Используйте Vmax в мкмоль/(мин·мл), а [E] — в мг/мл, чтобы единицы сократились до Е/мг.

Что такое единица (U) активности фермента? Одна единица — это количество фермента, превращающее 1 µmol субстрата за минуту в заданных условиях, согласно определению IUBMB.

Почему формула не включает время реакции? Vmax уже выражается как количество в минуту, то есть является скоростью, а не общим количеством. Повторное деление на время привело бы к двойному учёту и сделало бы результат зависимым от продолжительности анализа, чего не должно быть для свойства самого фермента.

Почему удельная активность снижается при увеличении концентрации фермента? Скорость в уравнении Михаэлиса—Ментен не зависит от концентрации фермента. Удельная активность — это фиксированная скорость, делённая на [E], поэтому большее значение [E] даёт меньший результат. Для корректного сравнения ферментных препаратов с разной концентрацией сравнивают удельную активность, а не саму скорость.

Что означает низкое Km? Низкое Km означает, что фермент достигает половины максимальной скорости при низкой концентрации субстрата; это указывает на прочное связывание фермента с субстратом.

Может ли удельная активность быть отрицательной? Нет. Отрицательный результат указывает на ошибку во входных данных, например отрицательную концентрацию, или на ошибку вычисления, а не на реальное измерение активности фермента.

Источники

1. Michaelis, L., & Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2012). Biochemistry (7-е изд.). W.H. Freeman and Company.
3. International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Номенклатура ферментов. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. База данных ферментов BRENDA. https://www.brenda-enzymes.org/