Калькулятор растворимости белков - Бесплатный инструмент для pH и температуры

Калькулятор растворимости белков оценивает максимальную концентрацию белка, которая сохраняется в растворённом состоянии в растворителе при заданных pH, температуре и ионной силе. Он сводит базовые химические расчёты к одному числу — количеству миллиграммов белка на миллилитр растворителя.

Растворимость белков важна в биохимии, разработке лекарственных форм и пищевой науке. Белок, который не сохраняется в растворённом состоянии, образует агрегаты или осадок, что может испортить эксперимент или сделать препарат непригодным для инъекционного введения.

Как рассчитать растворимость белка

Растворимость зависит от пяти факторов: изоэлектрической точки белка (pH, при котором его суммарный заряд равен нулю), температуры плавления белка (температуры, при которой он начинает разворачиваться), диэлектрической проницаемости растворителя (показателя того, насколько хорошо он разделяет заряженные частицы), pH раствора и ионной силы (показателя количества растворённой соли).

Калькулятор начинает с известной растворимости каждого белка в воде при стандартных условиях: 25 °C, pH 7,0 и ионной силе 0,15 M (примерно соответствующей уровню соли в крови). Затем он умножает это справочное значение на четыре коэффициента, по одному для каждого изменившегося условия.

Формула растворимости белка

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ — известная растворимость белка в воде при стандартных условиях, в мг/мл.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, где $pI$ — изоэлектрическая точка белка. Растворимость минимальна в изоэлектрической точке и повышается по мере удаления pH от неё, выходя на плато в пределах нескольких единиц pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, где $I$ — ионная сила в молях на литр. При низком содержании соли этот множитель немного повышает растворимость («всаливание»). При высоком содержании соли он снижает растворимость («высаливание»).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, где $T_m$ — температура плавления белка в °C. Растворимость постепенно повышается с температурой, а затем резко падает, когда температура приближается к $T_m$ и белок начинает разворачиваться.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, где $\varepsilon$ — диэлектрическая проницаемость растворителя. Диэлектрическая проницаемость воды равна 78,4, поэтому в воде этот член равен 1. Растворители, которые разделяют заряды менее эффективно, чем вода, например этанол, снижают растворимость.

Справочные значения, используемые калькулятором

Категории растворимости

Пример: альбумин в фосфатном буфере

Найдём растворимость альбумина в фосфатном буфере при 25 °C, pH 7,4 и ионной силе 0,15 M.

Справочные значения для альбумина: $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ мг/мл и $T_m = 63°C$. Диэлектрическая проницаемость фосфатного буфера равна 76,0.

1. Член pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Отношение: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Ионный член: ионная сила (0,15 M) равна справочному значению, поэтому отношение равно 1.
3. Температурный член: температура (25 °C) равна справочному значению, поэтому отношение равно 1.
4. Член растворителя: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ мг/мл}$

Калькулятор выдаёт значение 492,12 мг/мл, которое относится к категории «хорошо растворимый».

Пример: лизоцим в глицерине при низкой температуре

Найдём растворимость лизоцима в растворе глицерина при 4 °C, pH 5,0 и ионной силе 0,1 M. Эти условия близки к условиям хранения фермента в холоде.

Справочные значения для лизоцима: $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ мг/мл и $T_m = 72°C$. Диэлектрическая проницаемость глицерина равна 42,5.

1. Член pH: изменение pH с 7,0 до 5,0 (оба значения значительно ниже pI 11,35) лишь незначительно изменяет этот член. Отношение: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Ионный член: снижение ионной силы с 0,15 M до 0,1 M немного повышает растворимость благодаря эффекту всаливания. Отношение: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Температурный член: охлаждение с 25 °C до 4 °C, значительно ниже температуры плавления, снижает этот член. Отношение: 0,8106 $$.
4. Член растворителя: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ мг/мл}$

Калькулятор выдаёт значение 35,88 мг/мл, которое относится к категории «растворимый». Результат снижается относительно справочного значения из-за низкой диэлектрической проницаемости глицерина, а не из-за низкой температуры.

Как пользоваться калькулятором растворимости белков

1. Выберите белок из списка: альбумин, инсулин, лизоцим, гемоглобин, миоглобин, коллаген, казеин или фибриноген.
2. Выберите растворитель: воду, фосфатный буфер, трис-буфер, глицерин, ДМСО, метанол, этанол или ацетон.
3. Введите температуру в °C (от 0 до 100), pH (от 0 до 14) и ионную силу в молях на литр (от 0 до 2).
4. Просмотрите рассчитанную растворимость в мг/мл и её категорию. Полоса под результатом показывает значение на шкале от 0 до 100 мг/мл и полностью заполняется при значении 100 мг/мл или более.

Факторы, влияющие на растворимость белков

pH и изоэлектрическая точка. Каждый белок имеет изоэлектрическую точку — значение pH, при котором суммарный электрический заряд его поверхности равен нулю. При таком pH молекулы белка не отталкиваются друг от друга, поэтому слипаются и легче выпадают из раствора. Изменение pH в любую сторону от изоэлектрической точки придаёт белку суммарный заряд. Заряженные молекулы отталкиваются друг от друга, поэтому не слипаются и остаются растворёнными.

Ионная сила. Растворённые ионы соли окружают заряженные группы на поверхности белка. При низких и умеренных концентрациях эти ионы экранируют заряды, которые в противном случае притягивали бы две молекулы белка, тем самым повышая растворимость. Это называется всаливанием. При высоких концентрациях соли ионы конкурируют с белком за молекулы воды, удаляя водный слой, который поддерживает белок в растворённом состоянии. Этот процесс называется высаливанием; на нём основан распространённый метод очистки, при котором сульфат аммония используют для осаждения белков из смеси.

Температура. Нагревание раствора обычно повышает растворимость до определённого предела. Когда температура приближается к температуре плавления белка, белок начинает разворачиваться. При разворачивании открываются гидрофобные (отталкивающие воду) участки белка, обычно скрытые внутри его свёрнутой структуры. Эти открывшиеся участки слипаются друг с другом, вызывая агрегацию, поэтому около температуры плавления и выше растворимость резко падает.

Растворитель. Диэлектрическая проницаемость растворителя показывает, насколько эффективно он ослабляет электрическое притяжение между заряженными частицами. Вода имеет высокую диэлектрическую проницаемость и хорошо разделяет заряды, поэтому большинство белков растворяется в воде лучше, чем в органических растворителях, таких как этанол или ацетон. Растворители с низкой диэлектрической проницаемостью позволяют противоположным зарядам на разных молекулах белка сильнее притягиваться друг к другу, способствуя агрегации.

Ограничения

Калькулятор использует упрощённую модель, построенную на небольшом наборе справочных белков и стандартных растворителей. Модель не учитывает чистоту белка, добавки вроде детергентов или стабилизаторов, а также необычные компоненты буфера. Результаты — это оценки для планирования экспериментов, а не замена прямому измерению растворимости в лаборатории.

Часто задаваемые вопросы

Что такое растворимость белка? Растворимость белка — это максимальная концентрация белка, при которой он полностью сохраняется в растворённом состоянии без образования видимых агрегатов или осадка.

Почему растворимость белка минимальна в изоэлектрической точке? В изоэлектрической точке суммарный электрический заряд белка равен нулю, поэтому молекулы белка перестают электрически отталкиваться друг от друга. Без этого отталкивания они с большей вероятностью слипаются и выпадают из раствора.

В чём разница между всаливанием и высаливанием? Всаливание происходит при низких концентрациях соли: растворённые ионы экранируют заряженные группы белка друг от друга и повышают растворимость. Высаливание происходит при высоких концентрациях соли: ионы удаляют воду с поверхности белка и снижают растворимость.

Всегда ли повышение температуры увеличивает растворимость? Нет. Растворимость обычно повышается с температурой только до определённого предела. Когда температура приближается к температуре плавления белка, белок начинает разворачиваться, что обычно вызывает агрегацию и резкое снижение растворимости.

Почему белки хуже растворяются в этаноле или ацетоне, чем в воде? Вода имеет высокую диэлектрическую проницаемость, то есть очень эффективно ослабляет электрическое притяжение между заряженными участками молекул белка. У этанола и ацетона диэлектрическая проницаемость ниже, поэтому заряженные группы на разных молекулах белка сильнее притягиваются друг к другу в этих растворителях, что повышает вероятность агрегации.

Насколько точен этот калькулятор? Он даёт оценку на основе физической модели и небольшого набора справочных белков и растворителей. Калькулятор помогает сузить круг условий для проверки, но подтвердить растворимость конкретного образца белка можно только экспериментальным измерением.

Дополнительная литература

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.