Расчет точных объемов образцов на основе показаний абсорбции анализа BCA и желаемой массы белка. Необходимо для стабильной загрузки белка в вестерн-блотах и других лабораторных приложениях.
Этот инструмент рассчитывает необходимый объем образца на основе результатов абсорбции BCA и массы образца. Введите значение абсорбции и массу образца для каждого образца, чтобы рассчитать соответствующий объем образца.
Объем образца рассчитывается по следующей формуле:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Калькулятор объема образца для измерения абсорбции BCA — это специализированный инструмент, разработанный для помощи исследователям и лабораторным техникам в точном определении подходящего объема образца для экспериментов на основе результатов анализа BCA (бицинхоновой кислоты). Этот калькулятор принимает показания абсорбции из вашего анализа BCA и желаемую массу образца, чтобы рассчитать точный объем, необходимый для стабильной загрузки белка в таких приложениях, как вестерн-блоттинг, ферментативные анализы и другие методы анализа белков.
Анализ BCA является одним из самых широко используемых методов количественного определения белка в лабораториях биохимии и молекулярной биологии. Измеряя абсорбцию ваших образцов белка и сравнивая их с кривой стандарта, вы можете определить концентрацию белка с высокой точностью. Наш калькулятор упрощает этот процесс, автоматически преобразуя показания абсорбции в точные объемы образцов, необходимые для ваших экспериментов.
Анализ бицинхоновой кислоты (BCA) — это биохимический анализ для определения общей концентрации белка в растворе. Принцип этого анализа основан на образовании комплекса Cu²⁺-белка в щелочных условиях, за которым следует восстановление Cu²⁺ до Cu¹⁺. Количество восстановления пропорционально количеству белка. BCA образует пурпурный комплекс с Cu¹⁺ в щелочной среде, что служит основой для мониторинга восстановления меди белками.
Интенсивность пурпурного цвета увеличивается пропорционально концентрации белка, что можно измерить с помощью спектрофотометра при примерно 562 нм. Показания абсорбции затем сравниваются с кривой стандарта для определения концентрации белка в неизвестных образцах.
Основная формула для расчета объема образца на основе результатов абсорбции BCA:
Где:
Концентрация белка рассчитывается из показания абсорбции с использованием уравнения кривой стандарта:
Для стандартного анализа BCA типичный наклон составляет примерно 2.0, а пересечение часто близко к нулю, хотя эти значения могут варьироваться в зависимости от условий вашего анализа и кривой стандарта.
Наш калькулятор упрощает процесс определения объемов образцов на основе результатов анализа BCA. Следуйте этим шагам, чтобы получить точные расчеты:
Введите информацию об образце:
Выберите тип кривой стандарта:
Просмотрите результаты:
Скопируйте или экспортируйте результаты:
Давайте рассмотрим практический пример:
Это означает, что вам следует загрузить 13.33 μL вашего образца, чтобы получить 20 μg белка.
Калькулятор предоставляет несколько важных данных:
Концентрация белка: Это значение рассчитывается из вашего показания абсорбции с использованием выбранной кривой стандарта. Оно представляет собой количество белка на единицу объема в вашем образце (μg/μL).
Объем образца: Это объем вашего образца, содержащий желаемое количество белка. Это значение вы будете использовать при подготовке ваших экспериментов.
Предупреждения и рекомендации: Калькулятор может предоставить предупреждения для:
Одним из самых распространенных применений этого калькулятора является подготовка образцов для вестерн-блоттинга. Согласованная загрузка белка имеет решающее значение для надежных результатов вестерн-блоттинга, и этот калькулятор гарантирует, что вы загружаете одинаковое количество белка для каждого образца, даже когда их концентрации различаются.
Пример рабочего процесса:
Для ферментативных анализов часто необходимо использовать определенное количество белка для стандартизации условий реакции между различными образцами или экспериментами.
Пример рабочего процесса:
В экспериментах по иммуноосаждению (IP) важно начинать с согласованного количества белка для сравнения результатов между различными условиями.
Пример рабочего процесса:
Во время очищения белка часто необходимо отслеживать концентрацию белка и рассчитывать выходы на различных этапах.
Пример рабочего процесса:
Хотя калькулятор предоставляет значения по умолчанию для стандартных анализов BCA, вы также можете ввести пользовательские значения, если вы создали свою собственную кривую стандарта. Это особенно полезно, когда:
Чтобы использовать пользовательскую кривую стандарта:
Калькулятор позволяет вам добавлять несколько образцов и одновременно рассчитывать их объемы. Это особенно полезно при подготовке образцов для экспериментов, которые требуют согласованной загрузки белка между несколькими условиями.
Преимущества пакетной обработки:
Если ваше показание абсорбции выше 2.0, оно может находиться за пределами линейного диапазона анализа BCA. В таких случаях:
Для показаний абсорбции ниже 0.1 вы можете находиться близко к пределу обнаружения анализа, что может повлиять на точность. Рассмотрите возможность:
Если калькулятор предлагает объем, который слишком велик для вашего приложения:
Точное количественное определение белков было основным требованием в биохимии и молекулярной биологии с тех пор, как эти области возникли. Ранние методы основывались на определении содержания азота, что было трудоемким и требовало специализированного оборудования.
Метод Кьельдаля (1883): Один из первых методов количественного определения белка, основанный на измерении содержания азота.
Биуретный тест (начало 1900-х): Этот метод основывается на реакции между пептидными связями и ионами меди в щелочном растворе, производя фиолетовый цвет.
Анализ Лоури (1951): Разработанный Оливером Лоури, этот метод сочетал биуретную реакцию с реагентом Фолина-Циолкальтеу, увеличивая чувствительность.
Анализ Бредфорда (1976): Марион Бредфорд разработала этот метод, используя краситель Кумаcи Бриллиантовый Синий G-250, который связывается с белками и смещает максимальную абсорбцию.
Анализ BCA (1985): Разработанный Полом Смитом и коллегами из компании Pierce Chemical, этот метод сочетал биуретную реакцию с обнаружением BCA, предлагая улучшенную чувствительность и совместимость с детергентами.
Анализ BCA был впервые описан в статье 1985 года Смитом и др. под названием "Измерение белка с использованием бицинхоновой кислоты". Он был разработан для устранения ограничений существующих методов, особенно помех от различных химических веществ, часто используемых в экстракции и очистке белка.
Ключевым нововведением было использование бицинхоновой кислоты для обнаружения ионов Cu¹⁺, производимых белковым восстановлением Cu²⁺, образуя пурпурный комплекс, который можно было измерить спектрофотометрически. Это обеспечило несколько преимуществ:
С момента своего появления анализ BCA стал одним из самых широко используемых методов количественного определения белка в лабораториях биохимии и молекулярной биологии по всему миру.
1=IF(B2<=0,"Ошибка: Неверная абсорбция",IF(C2<=0,"Ошибка: Неверная масса образца",C2/(2*B2)))
2
3' Где:
4' B2 содержит показание абсорбции
5' C2 содержит желаемую массу образца в μg
6' Формула возвращает необходимый объем образца в μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Рассчитать концентрацию белка из абсорбции с использованием кривой стандарта."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Абсорбция не может быть отрицательной")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Рассчитать необходимый объем образца на основе абсорбции и желаемой массы."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Масса образца должна быть положительной")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Рассчитанная концентрация белка должна быть положительной")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Пример использования
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Для абсорбции {absorbance} и желаемой массы белка {sample_mass} μg:")
31 print(f"Концентрация белка: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Необходимый объем образца: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Ошибка: {e}")
351# Функция для расчета концентрации белка из абсорбции
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Абсорбция не может быть отрицательной")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Функция для расчета объема образца
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Масса образца должна быть положительной")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Рассчитанная концентрация белка должна быть положительной")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Пример использования
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Для абсорбции %.2f и желаемой массы белка %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Концентрация белка: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Необходимый объем образца: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Ошибка: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Абсорбция не может быть отрицательной");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Масса образца должна быть положительной");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Рассчитанная концентрация белка должна быть положительной");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Пример использования
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Для абсорбции ${absorbance} и желаемой массы белка ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Концентрация белка: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Необходимый объем образца: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Ошибка: ${error.message}`);
37}
38Связь между абсорбцией и концентрацией белка обычно линейна в пределах определенного диапазона. Ниже представлена визуализация стандартной кривой BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Разные методы количественного определения белка имеют различные преимущества и ограничения. Вот как анализ BCA сравнивается с другими распространенными методами:
| Метод | Диапазон чувствительности | Преимущества | Ограничения | Лучше всего для |
|---|---|---|---|---|
| Анализ BCA | 5-2000 μg/mL | • Совместимость с детергентами • Меньшая вариативность белка к белку • Стабильное развитие цвета | • Подвержен помехам от восстанавливающих агентов • Подвержен влиянию некоторых хелатирующих агентов | • Общая количественная оценка белка • Образцы, содержащие детергенты |
| Анализ Бредфорда | 1-1500 μg/mL | • Быстрый (2-5 мин) • Немного мешающих веществ | • Высокая вариативность белка к белку • Несовместимость с детергентами | • Быстрые измерения • Образцы без детергентов |
| Метод Лоури | 1-1500 μg/mL | • Хорошо зарекомендовал себя • Хорошая чувствительность | • Множество мешающих веществ • Многоступенчатый процесс | • Историческая согласованность • Чистые образцы белка |
| Ультрафиолетовая абсорбция (280 нм) | 20-3000 μg/mL | • Неразрушающий • Очень быстрый • Не требует реагентов | • Подвержен влиянию нуклеиновых кислот • Требует чистых образцов | • Чистые белковые растворы • Быстрая проверка в процессе очистки |
| Флуорометрический | 0.1-500 μg/mL | • Наивысшая чувствительность • Широкий динамический диапазон | • Дорогие реагенты • Требует флуориметра | • Очень разбавленные образцы • Ограниченный объем образца |
Анализ BCA (бицинхоновой кислоты) в первую очередь используется для количественного определения общей концентрации белка в образце. Он широко используется в биохимии, клеточной биологии и молекулярной биологии для таких приложений, как вестерн-блоттинг, ферментативные анализы, иммуноосаждение и очистка белка.
Анализ BCA обычно точен в пределах 5-10%, если он выполнен правильно. Его точность зависит от нескольких факторов, включая качество кривой стандарта, отсутствие мешающих веществ и то, насколько состав неизвестного белка схож с используемым стандартным белком.
Несколько веществ могут помешать результатам анализа BCA, включая:
Основные различия заключаются в следующем:
Если ваш калькулятор показывает очень большой объем образца, это обычно указывает на низкую концентрацию белка в вашем образце. Это может быть связано с:
Рассмотрите возможность концентрации вашего образца или корректировки вашего экспериментального дизайна, чтобы учесть более низкую концентрацию белка.
Этот калькулятор специально разработан для результатов анализа BCA. Хотя основной принцип (преобразование концентрации в объем) применим к другим методам, связь между абсорбцией и концентрацией белка варьируется между различными анализами. Для других методов, таких как Бредфорд или Лоури, вам нужно будет использовать различные параметры кривой стандарта.
Для показаний абсорбции за пределами линейного диапазона (обычно >2.0):
Сывороточный альбумин коровы (BSA) является наиболее часто используемым стандартом для анализов BCA, потому что он:
Тем не менее, если ваши образцы содержат преобладающий белок, который значительно отличается от BSA, рассмотрите возможность использования этого белка в качестве стандарта для более точных результатов.
Пурпурный цвет, развивающийся в реакции BCA, стабилен в течение нескольких часов при комнатной температуре и может быть измерен в любое время в течение этого периода. Однако для достижения наилучших результатов рекомендуется измерять все стандарты и образцы примерно в одно и то же время после развития цвета.
Хотя технически возможно повторно использовать кривую стандарта, это не рекомендуется для точного количественного определения. Изменения в реагентах, условиях инкубации и калибровке инструмента могут повлиять на взаимосвязь между абсорбцией и концентрацией белка. Для надежных результатов создавайте свежую кривую стандарта каждый раз, когда вы проводите анализ.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT и др. "Измерение белка с использованием бицинхоновой кислоты." Аналитическая биохимия. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Набор для анализа белка Pierce BCA." Инструкции. Доступно по адресу: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "Анализ бицинхоновой кислоты (BCA) для количественного определения белка." В: Walker JM, ред. Руководство по протоколам белка. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Методы определения концентрации белка." Текущие протоколы в белковой науке. 2007;Глава 3:Единица 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Количественное определение белка." Методы в энзимологии. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Теперь, когда вы понимаете принципы количественного определения белка BCA и расчета объема образца, попробуйте наш калькулятор, чтобы упростить ваш лабораторный рабочий процесс. Просто введите ваши показания абсорбции и желаемую массу образца, чтобы получить мгновенные, точные расчеты объема образца.
Будь то подготовка образцов для вестерн-блоттинга, ферментативных анализов или любого другого эксперимента на основе белка, наш калькулятор поможет обеспечить согласованные и надежные результаты. Сэкономьте время, уменьшите ошибки и улучшите воспроизводимость ваших экспериментов с помощью калькулятора объема образца для измерения абсорбции BCA.
Откройте больше инструментов, которые могут быть полезны для вашего рабочего процесса