Kalkulator topnosti beljakovin - Brezplačno orodje za pH in temperaturo

Kalkulator topnosti beljakovin oceni najvišjo koncentracijo beljakovine, ki ostane raztopljena v topilu pri danem pH, temperaturi in ionski jakosti. Osnovno kemijo pretvori v eno samo številčno vrednost, izraženo v miligramih beljakovine na mililiter topila.

Topnost beljakovin je pomembna v biokemiji, formulaciji zdravil in živilski znanosti. Beljakovina, ki ne ostane raztopljena, tvori agregate ali oborine, kar lahko pokvari poskus ali onemogoči injiciranje zdravila.

Kako izračunati topnost beljakovin

Topnost je odvisna od petih dejavnikov: izoelektrične točke beljakovine (pH, pri katerem je njen neto naboj enak nič), tališča (temperature, pri kateri se začne odvijati), dielektrične konstante topila (merila, kako dobro ločuje nabite delce), pH-vrednosti raztopine in ionske jakosti (merila količine raztopljene soli).

Kalkulator izhaja iz znane topnosti posamezne beljakovine v vodi pri referenčnih pogojih: 25 °C, pH 7,0 in ionski jakosti 0,15 M (približno toliko soli je v krvi). Nato referenčno vrednost pomnoži s štirimi razmerji, po enim za vsak spremenjeni pogoj.

Formula za topnost beljakovin

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ je znana topnost beljakovine v vodi pri referenčnih pogojih, izražena v mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, kjer je $pI$ izoelektrična točka beljakovine. Topnost je najmanjša pri izoelektrični točki in narašča, ko se pH od nje oddaljuje, nato pa se v nekaj pH-enotah ustali.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, kjer je $I$ ionska jakost v molih na liter. Pri nizkih koncentracijah soli ta člen nekoliko poveča topnost (»soljenje«). Pri visokih koncentracijah soli jo zmanjša (»izsoljevanje«).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, kjer je $T_m$ tališče beljakovine v °C. Topnost s temperaturo počasi narašča, nato pa močno upade, ko se temperatura približa $T_m$ in se beljakovina začne odvijati.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, kjer je $\varepsilon$ dielektrična konstanta topila. Voda ima dielektrično konstanto 78,4, zato je ta člen v vodi enak 1. Topila, ki naboje ločujejo manj učinkovito kot voda, na primer etanol, zmanjšajo topnost.

Referenčne vrednosti, ki jih uporablja kalkulator

Kategorije topnosti

Primer: albumin v fosfatnem pufru

Določite topnost albumina v fosfatnem pufru pri 25 °C, pH 7,4 in ionski jakosti 0,15 M.

Referenčne vrednosti albumina so $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL in $T_m = 63°C$. Fosfatni pufer ima dielektrično konstanto 76,0.

1. Člen pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Razmerje: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Ionski člen: ionska jakost (0,15 M) je enaka referenčni vrednosti, zato je razmerje 1.
3. Temperaturni člen: temperatura (25 °C) je enaka referenčni vrednosti, zato je razmerje 1.
4. Člen topila: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Kalkulator izračuna 492,12 mg/mL, kar spada v kategorijo »zelo topen«.

Primer: lizocim v glicerolu pri nizki temperaturi

Poiščite topnost lizocima v raztopini glicerola pri 4 °C, pH 5,0 in ionski jakosti 0,1 M. To so pogoji, podobni hladnemu shranjevanju encima.

Referenčne vrednosti lizocima so $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL in $T_m = 72°C$. Glicerol ima dielektrično konstanto 42,5.

1. Člen pH: prehod s pH 7,0 na pH 5,0 (oboje precej pod pI-vrednostjo 11,35) le malo spremeni člen pH. Razmerje: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Ionski člen: zmanjšanje ionske jakosti z 0,15 M na 0,1 M nekoliko poveča topnost zaradi zasoljevalnega učinka. Razmerje: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperaturni člen: hlajenje z 25 °C na 4 °C, precej pod tališčem, zmanjša ta člen. Razmerje: 0,8106.
4. Člen topila: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Kalkulator prikaže 35,88 mg/mL, kar spada v kategorijo »topno«. Rezultat od referenčne vrednosti zniža nizka dielektrična konstanta glicerola, ne nizka temperatura.

Kako uporabljati kalkulator topnosti beljakovin

1. Izberite beljakovino s seznama: albumin, insulin, lizocim, hemoglobin, mioglobin, kolagen, kazein ali fibrinogen.
2. Izberite topilo: voda, fosfatni pufer, Trisov pufer, glicerol, DMSO, metanol, etanol ali aceton.
3. Vnesite temperaturo v °C (od 0 do 100), pH (od 0 do 14) in ionsko jakost v molih na liter (od 0 do 2).
4. Preberite izračunano topnost v mg/mL in njeno kategorijo. Vrstica pod rezultatom prikazuje vrednost na lestvici od 0 do 100 mg/mL in se v celoti zapolni pri 100 mg/mL ali več.

Kaj vpliva na topnost beljakovin

pH in izoelektrična točka. Vsaka beljakovina ima izoelektrično točko, pH, pri katerem na njeni površini ni neto električnega naboja. Pri tem pH se molekule beljakovin med seboj ne odbijajo, zato se zlepljajo in laže izločijo iz raztopine. Če pH premaknemo stran od izoelektrične točke v katero koli smer, beljakovina dobi neto naboj. Nabite molekule se med seboj odbijajo, zato ostanejo ločene in raztopljene.

Ionska jakost. Raztopljeni ioni soli obdajajo nabite površinske skupine beljakovine. Pri nizkih do zmernih koncentracijah ti ioni zaslonijo naboje, ki bi sicer privlačili dve molekuli beljakovine, s čimer povečajo topnost. To se imenuje vsoljevanje. Pri visokih koncentracijah soli ioni tekmujejo z beljakovino za molekule vode in odstranijo plast vode, ki ohranja beljakovino raztopljeno. To se imenuje izsoljevanje in je osnova običajne metode čiščenja, pri kateri se za obarjanje beljakovin iz zmesi uporablja amonijev sulfat.

Temperatura. Segrevanje raztopine na splošno poveča topnost, vendar le do določene meje. Ko se temperatura približa tališču beljakovine, se ta začne odvijati. Pri tem se razkrijejo hidrofobni (vodo odvračajoči) deli beljakovine, ki so običajno skriti v njeni zviti strukturi. Ti razkriti deli se sprimejo, kar povzroči agregacijo, zato topnost blizu tališča in nad njim močno upade.

Topilo. Dielektrična konstanta topila meri, kako učinkovito oslabi električno privlačnost med nabitimi delci. Voda ima visoko dielektrično konstanto in dobro ločuje naboje, zato se večina beljakovin v vodi raztaplja bolje kot v organskih topilih, kot sta etanol ali aceton. Topila z nizko dielektrično konstanto omogočajo, da se nasprotni naboji na različnih molekulah beljakovin močneje privlačijo, kar spodbuja agregacijo.

Omejitve kalkulatorja

Kalkulator uporablja poenostavljen model, zgrajen na majhnem naboru referenčnih beljakovin in standardnih topil. Ne upošteva čistosti beljakovine, dodatkov, kot so detergenti ali stabilizatorji, niti nenavadnih sestavin pufra. Rezultati so ocene za načrtovanje poskusov in ne nadomestijo neposrednega merjenja topnosti v laboratoriju.

Pogosta vprašanja

Kaj je topnost beljakovin? Topnost beljakovin je največja koncentracija beljakovine, ki ostane popolnoma raztopljena v topilu, ne da bi tvorila vidne agregate ali oborino.

Zakaj je beljakovina najmanj topna pri izoelektrični točki? Pri izoelektrični točki beljakovina nima neto električnega naboja, zato se molekule beljakovin med seboj električno ne odbijajo več. Brez tega odboja se laže sprimejo in izločijo iz raztopine.

Kakšna je razlika med vsoljevanjem in izsoljevanjem? Vsoljevanje se pojavi pri nizkih koncentracijah soli, ko raztopljeni ioni zaslonijo nabite skupine beljakovine pred medsebojnim privlačenjem in povečajo topnost. Izsoljevanje se pojavi pri visokih koncentracijah soli, ko ioni odstranijo vodo s površine beljakovine in zmanjšajo topnost.

Ali višja temperatura vedno poveča topnost? Ne. Topnost se s temperaturo navadno povečuje le do določene meje. Ko se temperatura približa tališču beljakovine, se ta začne odvijati, kar običajno povzroči agregacijo in močan upad topnosti.

Zakaj se beljakovine v etanolu ali acetonu raztapljajo slabše kot v vodi? Voda ima visoko dielektrično konstanto, kar pomeni, da zelo učinkovito oslabi električno privlačnost med nabitimi deli molekul beljakovin. Etanol in aceton imata nižji dielektrični konstanti, zato se nabite skupine na različnih molekulah beljakovin v teh topilih močneje privlačijo, zaradi česar je agregacija verjetnejša.

Kako natančen je ta kalkulator? Podaja oceno na podlagi fizikalnega modela ter majhnega nabora referenčnih beljakovin in topil. Uporaben je za zoženje nabora pogojev, ki jih je treba preizkusiti, vendar je eksperimentalno merjenje še vedno edini način za potrditev topnosti določenega vzorca beljakovine.

Dodatno branje

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mehanizem zasoljevanja beljakovin navznoter in navzven s solmi dvovalentnih kationov. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., in Pace, C. N. (2008). Merjenje in povečevanje topnosti beljakovin. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., in Edsall, J. T. (1943). Proteini, aminokisline in peptidi kot ioni in dipolarni ioni. Reinhold Publishing.