Izračunajte natančne prostornine vzorcev na podlagi absorpcijskih meritev BCA testa in želenih mas beljakovin. Ključno za dosledno nalaganje beljakovin pri zahodnih blotih in drugih laboratorijskih aplikacijah.
Ta orodje izračuna zahtevano prostornino vzorca na podlagi rezultatov absorbance BCA in mase vzorca. Vnesite vrednost absorbance in maso vzorca za vsak vzorec, da izračunate ustrezno prostornino vzorca.
Prostornina vzorca se izračuna z naslednjo formulo:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbance Sample Volume Calculator je specializirano orodje, zasnovano za pomoč raziskovalcem in laboratorijskim tehniki pri natančnem določanju ustreznega volumna vzorca za eksperimente na podlagi rezultatov BCA (bicinchoninske kisline) testa. To orodje vzame meritve absorpcije iz vašega BCA testa in želeno maso vzorca, da izračuna natančen volumen, potreben za dosledno nalaganje beljakovin v aplikacijah, kot so western blotting, encimski testi in druge tehnike analize beljakovin.
BCA test je ena najbolj široko uporabljenih metod za kvantifikacijo beljakovin v biokemijskih in molekularno-bioloških laboratorijih. Z merjenjem absorpcije vaših beljakovinskih vzorcev in primerjavo z standardno krivuljo lahko določite koncentracijo beljakovin z visoko natančnostjo. Naš kalkulator poenostavi ta postopek z avtomatskim pretvorbo meritev absorpcije v točne volume vzorcev, potrebne za vaše eksperimente.
Bicinchoninska kislina (BCA) test je biokemični test za določanje skupne koncentracije beljakovin v raztopini. Načelo tega testa temelji na oblikovanju Cu²⁺-beljakovinskega kompleksa pod alkalnimi pogoji, ki mu sledi redukcija Cu²⁺ v Cu¹⁺. Količina redukcije je sorazmerna s prisotnostjo beljakovin. BCA tvori vijolični kompleks s Cu¹⁺ v alkalnem okolju, kar predstavlja osnovo za spremljanje redukcije bakra s beljakovinami.
Intenzivnost vijolične barve se povečuje sorazmerno s koncentracijo beljakovin, kar je mogoče izmeriti z uporabo spektrofotometra pri približno 562 nm. Meritve absorpcije se nato primerjajo s standardno krivuljo za določitev koncentracije beljakovin v neznanih vzorcih.
Osnovna formula za izračun volumna vzorca iz rezultatov absorpcije BCA je:
Kjer:
Koncentracija beljakovin se izračuna iz meritve absorpcije z uporabo enačbe standardne krivulje:
Za standardni BCA test je tipični naklon približno 2.0, presek pa je pogosto blizu nič, čeprav se lahko ti vrednosti razlikujejo glede na specifične pogoje vašega testa in standardno krivuljo.
Naš kalkulator poenostavi postopek določanja volumnov vzorcev iz rezultatov BCA testa. Sledite tem korakom, da dobite natančne izračune:
Vnesite informacije o vzorcu:
Izberite vrsto standardne krivulje:
Ogled rezultatov:
Kopirajte ali izvozite rezultate:
Poglejmo praktičen primer:
To pomeni, da bi morali naložiti 13.33 μL vašega vzorca, da dobite 20 μg beljakovin.
Kalkulator zagotavlja več pomembnih informacij:
Koncentracija beljakovin: To se izračuna iz vaše meritve absorpcije z uporabo izbrane standardne krivulje. Predstavlja količino beljakovin na enoto volumna v vašem vzorcu (μg/μL).
Volumen vzorca: To je volumen vašega vzorca, ki vsebuje želeno količino beljakovin. Ta vrednost je tisto, kar boste uporabili pri pripravi vaših eksperimentov.
Opozorila in priporočila: Kalkulator lahko zagotovi opozorila za:
Ena najpogostejših aplikacij za ta kalkulator je priprava vzorcev za western blotting. Dosledno nalaganje beljakovin je ključno za zanesljive rezultate western blota, in ta kalkulator zagotavlja, da naložite enako količino beljakovin za vsak vzorec, tudi ko se njihove koncentracije razlikujejo.
Primer delovnega toka:
Pri encimskih testih je pogosto potrebno uporabiti specifično količino beljakovin za standardizacijo reakcijskih pogojev med različnimi vzorci ali eksperimenti.
Primer delovnega toka:
Pri eksperimentih imunoprecipitacije je pomembno, da začnete z dosledno količino beljakovin za primerjavo rezultatov med različnimi pogoji.
Primer delovnega toka:
Med čiščenjem beljakovin je pogosto potrebno slediti koncentraciji beljakovin in izračunati donose na različnih korakih.
Primer delovnega toka:
Medtem ko kalkulator zagotavlja privzete parametre za standardne BCA teste, lahko vnesete tudi prilagojene vrednosti, če ste ustvarili svojo standardno krivuljo. To je še posebej koristno, ko:
Za uporabo prilagojene standardne krivulje:
Kalkulator vam omogoča dodajanje več vzorcev in hkratno izračunavanje njihovih volumnov. To je še posebej koristno pri pripravi vzorcev za eksperimente, ki zahtevajo dosledno nalaganje beljakovin med različnimi pogoji.
Prednosti obdelave serij:
Če je vaša meritev absorpcije nad 2.0, je lahko zunaj linearnega območja BCA testa. V takih primerih:
Za meritve absorpcije pod 0.1 ste morda blizu meje zaznavanja testa, kar lahko vpliva na natančnost. Razmislite o:
Če kalkulator predlaga volumen, ki je prevelik za vašo aplikacijo:
Natančna kvantifikacija beljakovin je bila temeljna zahteva v biokemiji in molekularni biologiji, odkar so se ta področja pojavila. Zgodnje metode so se zanašale na določanje vsebnosti dušika, kar je bilo zamudno in je zahtevalo specializirano opremo.
Kjeldahlova metoda (1883): Ena najzgodnejših metod za kvantifikacijo beljakovin, ki temelji na merjenju vsebnosti dušika.
Biuretov test (zgodnja 1900-a): Ta metoda se opira na reakcijo med peptidnimi vezmi in bakrovimi ioniziranimi v alkalni raztopini, kar povzroča vijolično barvo.
Lowryjeva metoda (1951): Razvila jo je Oliver Lowry, ta metoda združuje biuretovo reakcijo s Folin-Ciocalteu reagentom, kar povečuje občutljivost.
Bradfordov test (1976): Marion Bradford je razvila to metodo z uporabo barvila Coomassie Brilliant Blue G-250, ki se veže na beljakovine in premakne maksimum absorpcije.
BCA test (1985): Razvili so ga Paul Smith in njegovi sodelavci pri podjetju Pierce Chemical, ta metoda združuje biuretovo reakcijo z BCA detekcijo, kar ponuja izboljšano občutljivost in združljivost z detergenti.
BCA test je prvič opisan v članku iz leta 1985 avtorjev Smith et al. z naslovom "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Razvili so ga, da bi odpravili omejitve obstoječih metod, zlasti motnje zaradi različnih kemikalij, ki se pogosto uporabljajo pri ekstrakciji in čiščenju beljakovin.
Ključna inovacija je bila uporaba bicinchoninske kisline za zaznavanje Cu¹⁺ ionov, ki jih proizvaja redukcija Cu²⁺ s strani beljakovin, kar tvori vijolični kompleks, ki ga je mogoče meriti spektrofotometrično. To je prineslo več prednosti:
Od svojega uvajanja je BCA test postal ena najbolj široko uporabljenih metod kvantifikacije beljakovin v biokemijskih in molekularno-bioloških laboratorijih po vsem svetu.
1=IF(B2<=0,"Napaka: Neveljavna absorpcija",IF(C2<=0,"Napaka: Neveljavna masa vzorca",C2/(2*B2)))
2
3' Kjer:
4' B2 vsebuje meritev absorpcije
5' C2 vsebuje želeno maso vzorca v μg
6' Formula vrne potreben volumen vzorca v μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Izračunajte koncentracijo beljakovin iz absorpcije z uporabo standardne krivulje."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorpcija ne more biti negativna")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Izračunajte potreben volumen vzorca na podlagi absorpcije in želenega zneska."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Masa vzorca mora biti pozitivna")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Izračunana koncentracija beljakovin mora biti pozitivna")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Primer uporabe
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Za absorpcijo {absorbance} in želeno maso beljakovin {sample_mass} μg:")
31 print(f"Koncentracija beljakovin: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Potreben volumen vzorca: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Napaka: {e}")
351# Funkcija za izračun koncentracije beljakovin iz absorpcije
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorpcija ne more biti negativna")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcija za izračun volumna vzorca
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Masa vzorca mora biti pozitivna")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Izračunana koncentracija beljakovin mora biti pozitivna")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Primer uporabe
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Za absorpcijo %.2f in želeno maso beljakovin %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Koncentracija beljakovin: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Potreben volumen vzorca: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Napaka: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorpcija ne more biti negativna");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Masa vzorca mora biti pozitivna");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Izračunana koncentracija beljakovin mora biti pozitivna");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Primer uporabe
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Za absorpcijo ${absorbance} in želeno maso beljakovin ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Koncentracija beljakovin: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Potreben volumen vzorca: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Napaka: ${error.message}`);
37}
38Razmerje med absorpcijo in koncentracijo beljakovin je običajno linearno v določenem razponu. Spodaj je vizualizacija standardne BCA krivulje:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Različne metode kvantifikacije beljakovin imajo različne prednosti in omejitve. Tukaj je, kako se BCA test primerja z drugimi običajnimi metodami:
| Metoda | Občutljivost | Prednosti | Omejitve | Najboljša uporaba |
|---|---|---|---|---|
| BCA test | 5-2000 μg/mL | • Združljivost z detergenti • Manjša variabilnost med beljakovinami • Stabilna barvna razvoj | • Motnje zaradi redukcijskih sredstev • Vpliv nekaterih kelatnih sredstev | • Splošna kvantifikacija beljakovin • Vzorci, ki vsebujejo detergente |
| Bradfordov test | 1-1500 μg/mL | • Hiter (2-5 min) • Malo motenj | • Visoka variabilnost med beljakovinami • Nezdružljivost z detergenti | • Hitre meritve • Vzorci brez detergenta |
| Lowryjeva metoda | 1-1500 μg/mL | • Dobro uveljavljen • Dobra občutljivost | • Mnoge motnje • Več korakov | • Zgodovinska doslednost • Čisti beljakovinski vzorci |
| UV absorpcija (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Nedestruktivno • Zelo hitro • Ni potrebnih reagentov | • Vpliv nukleinskih kislin • Zahteva čiste vzorce | • Čiste beljakovinske raztopine • Hitri pregledi med čiščenjem |
| Fluorometrična | 0.1-500 μg/mL | • Najvišja občutljivost • Širok dinamični razpon | • Dragi reagenti • Zahteva fluorometer | • Zelo razredčeni vzorci • Omejen volumen vzorca |
BCA (bicinchoninska kislina) test se primarno uporablja za kvantifikacijo skupne koncentracije beljakovin v vzorcu. Široko se uporablja v biokemiji, celični biologiji in molekularni biologiji za aplikacije, kot so western blotting, encimski testi, imunoprecipitacija in čiščenje beljakovin.
BCA test je običajno natančen v razponu 5-10%, ko se pravilno izvede. Njegova natančnost je odvisna od več dejavnikov, vključno s kakovostjo standardne krivulje, odsotnostjo motenj in ali je sestava neznane beljakovine podobna standardni beljakovini, ki se uporablja.
Več snovi lahko moti rezultate BCA testa, vključno z:
Glavne razlike so:
Če kalkulator prikazuje zelo velik volumen vzorca, to običajno kaže na nizko koncentracijo beljakovin v vašem vzorcu. To bi lahko bilo posledica:
Razmislite o koncentraciji vašega vzorca ali prilagoditvi vašega eksperimentalnega načrta, da upoštevate nižje koncentracije beljakovin.
Ta kalkulator je posebej zasnovan za rezultate BCA testa. Medtem ko osnovna načela (pretvorba koncentracije v volumen) veljajo tudi za druge metode, se razmerje med absorpcijo in koncentracijo beljakovin razlikuje med različnimi testi. Za druge metode, kot so Bradford ali Lowry, bi morali uporabiti različne parametre standardne krivulje.
Za meritve absorpcije zunaj linearnega območja (običajno >2.0):
Bovine Serum Albumin (BSA) je najpogosteje uporabljeni standard za BCA teste, ker je:
Vendar, če vaši vzorci vsebujejo prevladujočo beljakovino, ki se bistveno razlikuje od BSA, razmislite o uporabi te beljakovine kot vašega standarda za natančnejše rezultate.
Vijolična barva, ki se razvije v BCA reakciji, je stabilna več ur pri sobni temperaturi in jo je mogoče meriti kadarkoli v tem obdobju. Vendar pa je za najboljše rezultate priporočljivo izmeriti vse standarde in vzorce približno ob istem času po razvoju barve.
Čeprav je tehnično mogoče ponovno uporabiti standardno krivuljo, to ni priporočljivo za natančno kvantifikacijo. Variacije v reagentih, pogojih inkubacije in kalibraciji instrumentov lahko vplivajo na razmerje med absorpcijo in koncentracijo beljakovin. Za zanesljive rezultate ustvarite svežo standardno krivuljo vsakič, ko izvedete test.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Navodila. Na voljo na: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Sedaj, ko razumete načela kvantifikacije beljakovin BCA in izračuna volumna vzorca, preizkusite naš kalkulator, da poenostavite svoje laboratorijske delovne tokove. Preprosto vnesite svoje meritve absorpcije in želeno maso vzorca, da dobite takojšnje, natančne izračune volumna vzorca.
Ne glede na to, ali pripravljate vzorce za western blotting, encimske teste ali katerikoli drug eksperiment, temelječ na beljakovinah, vam bo naš kalkulator pomagal zagotoviti dosledne in zanesljive rezultate. Prihranite čas, zmanjšajte napake in izboljšajte ponovljivost vaših eksperimentov z BCA Absorbance Sample Volume Calculator.
Odkrijte več orodij, ki bi lahko bila koristna za vaš delovni proces