Kalkulator volumna BCA | Orodje za kvantifikacijo proteinov

Kaj je kalkulator volumna vzorca BCA

Kalkulator volumna vzorca BCA pretvori odčitek absorbance pri testu beljakovin BCA v prostornino vzorca v mikrolitrih (μL), potrebno za nanos ciljne količine beljakovin. Uporablja se po izvedbi testa beljakovin z bicinkoninsko kislino (BCA), pogostega laboratorijskega testa, ki meri količino beljakovin v raztopini tako, da izmeri, koliko vijolične svetlobo absorbirajoče obarvanosti razvije vzorec.

Kako test BCA meri beljakovine

Test BCA poteka v dveh korakih. Najprej beljakovine v vzorcu v alkalni raztopini povzročijo redukcijo bakrovih ionov (Cu²⁺) v drugo obliko (Cu¹⁺). Količina redukcije je odvisna od količine prisotnih beljakovin. Nato se bicinkoninska kislina veže na reducirani baker in tvori vijolično spojino, ki močno absorbira svetlobo pri valovni dolžini 562 nanometrov (nm).

Spektrofotometer izmeri, koliko svetlobe vzorec absorbira pri 562 nm. Ta vrednost se imenuje absorbanca. Temnejša vijolična barva pomeni večjo absorbanco in več beljakovin. V laboratoriju se absorbanca vsakega vzorca primerja s standardno krivuljo, izdelano z merjenjem znanih koncentracij referenčne beljakovine, običajno govejega serumskega albumina (BSA).

BCA je priljubljen, ker deluje tudi, kadar vzorec vsebuje detergente, kot sta SDS ali Triton X-100, kemikalije, ki so pogoste v pufrih za lizo celic, vendar motijo starejši metodi Bradford in Lowry.

Formula za pretvorbo absorbance BCA v volumen vzorca

Standardna krivulja BCA je premica, prilagojena odvisnosti absorbance od koncentracije:

$\text{Absorbanca} = \text{Naklon} \times \text{Koncentracija} + \text{Odsek na osi}$

Če želimo izmerjeno absorbanco pretvoriti nazaj v koncentracijo beljakovin, enačbo preuredimo:

$\text{Koncentracija beljakovin (μg/μL)} = \frac{\text{Absorbanca} - \text{Odsek na osi}}{\text{Naklon}}$

Ko je koncentracija znana, je volumen vzorca, ki vsebuje ciljno maso beljakovin:

$\text{Volumen vzorca (μL)} = \frac{\text{Masa vzorca (μg)}}{\text{Koncentracija beljakovin (μg/μL)}}$

Kalkulator ponuja štiri prednastavljene vrste krivulj, vsaka s svojim naklonom in presečiščem z ordinatno osjo. Presečišče z ordinatno osjo je pri 0 v vsaki prednastavitvi, ker so meritve korigirane glede na slepi vzorec (absorbanca kontrolnega vzorca brez beljakovin se najprej odšteje). Naklon odraža, kolikšen del območja absorbance ploščice pokriva delovno območje posameznega protokola.

Občutljivejši protokol, namenjen razredčenim vzorcem, ustvari več absorbance na mikrogram beljakovin, zato ima večji naklon. Izboljšani BCA in mikro BCA sta namenjena vzorcem, ki so za natančno merjenje s standardnim protokolom preveč razredčeni.

Kako izračunati volumen vzorca iz absorbance BCA

1. Izvedite test BCA in pri 562 nm odčitajte absorbanco za vsak vzorec.
2. Izberite vrsto krivulje, ki ustreza uporabljenemu protokolu (standardni, izboljšani ali mikro), ali vnesite naklon in odsek na osi po meri iz krivulje, izdelane tisti dan.
3. Za vsak vzorec vnesite vrednost absorbance in ciljno maso beljakovin v mikrogramih.
4. Kalkulator pretvori absorbanco v koncentracijo beljakovin, nato ciljno maso deli s to koncentracijo in tako določi volumen za odpipetiranje.

Primer: izračun volumna vzorca iz absorbance BCA

Raziskovalec, ki pripravlja analizo western blot, potrebuje 20 μg beljakovin na progi in uporablja standardno krivuljo BCA (naklon 1,0, odsek na osi 0).

Vzorec A ima absorbanco 0,75:

• Koncentracija beljakovin = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 μg/μL
• Volumen vzorca = 20 μg ÷ 0,75 μg/μL = 26,67 μL

Vzorec B ima absorbanco 1,2:

• Koncentracija beljakovin = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 μg/μL
• Volumen vzorca = 20 μg ÷ 1,2 μg/μL = 16,67 μL

Vzorec A je bolj razredčen, zato je za doseganje iste ciljne vrednosti 20 μg potreben večji volumen.

Razumevanje rezultatov kalkulatorja

Kalkulator za vsak vzorec prikaže dve vrednosti: koncentracijo beljakovin v μg/μL in volumen vzorca v μL. Označi tudi rezultate, ki bi lahko povzročili težave:

• Absorbanca nad 3,0 sproži opozorilo, saj so običajne meritve BCA med 0 in 2,0.
• Absorbanca pod 0,05, vendar nad nič, sproži opozorilo, da je rezultat lahko manj natančen, ker je šibek signal bolj občutljiv na merilni šum.
• Izračunani volumen 1000 μL ali več sproži opozorilo, naj se uporabi bolj koncentriran vzorec.
• Izračunani volumen pod 0,5 μL sproži opozorilo, da je volumen morda težko natančno odpipetirati.
• Negativna absorbanca ali negativna masa vzorca se zavrne.

Praktična uporaba v laboratoriju

Enakomeren nanos beljakovin je ena najpogostejših težav pri analizi western blot: neenakomerna intenzivnost pasov med progami pogosto odraža neenakomeren nanos beljakovin, ne pa resničnih razlik v izražanju. Izračun natančnega volumna za vsak vzorec na podlagi njegove lastne meritve absorbance omogoča enakomeren nanos v vseh stezah gela.

Enak izračun velja za encimske teste, pri katerih je za primerjavo aktivnosti med pogoji treba začeti z enako skupno količino beljakovin, ter za imunoprecipitacijo, pri kateri neenakomerna količina vnesenih beljakovin (na primer 800 μg v eni epruveti v primerjavi z 1200 μg v drugi) otežuje primerjavo rezultatov. Pri čiščenju beljakovin se ista formula uporablja v vsakem koraku za spremljanje količine beljakovin, ki ostane v posamezni frakciji.

Primerjava z drugimi testi beljakovin

Kratka zgodovina kvantifikacije beljakovin

Zgodnje merjenje beljakovin je temeljilo na Kjeldahlovi metodi (1883), pri kateri se je po razgradnji vzorca v kislini merila vsebnost dušika. Biuretski test, razvit v začetku 1900-ih let, je uporabljal barvno reakcijo med peptidnimi vezmi in bakrovimi ioni, vendar ni bil zelo občutljiv. Oliver Lowry je leta 1951 združil biuretsko reakcijo z dodatnim reagentom in ustvaril Lowryjevo metodo, ki je desetletja prevladovala pri merjenju beljakovin, čeprav so jo motile pogoste laboratorijske kemikalije, kot sta detergenti in EDTA. Marion Bradford je leta 1976 uvedla hitrejšo metodo vezave barvila, vendar tudi ta ni delovala v prisotnosti detergentov, rezultat pa je bil odvisen od aminokislinske sestave beljakovine. Paul Smith in sodelavci iz podjetja Pierce Chemical Company so leta 1985 objavili metodo BCA, ki združuje biuretno kemijo z večjo občutljivostjo bicinkoninske kisline za baker, s čimer so ustvarili test, ki prenaša detergente, prisotne v običajnih celičnih lizatih.

Primer kode

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Pogosta vprašanja

Za kaj se uporablja test BCA? Meri skupno koncentracijo beljakovin v raztopini, najpogosteje pred nanosom enakih količin beljakovin pri analizi western blot, pred normalizacijo testov encimske aktivnosti ali pri spremljanju izplena med čiščenjem beljakovin.

Kako natančen je test BCA? V dobrih pogojih so rezultati običajno natančni v okviru 5–10%, če ima standardna krivulja vsaj pet ali šest točk in vzorec ne vsebuje visoke koncentracije moteče snovi.

Kaj moti rezultate testa BCA? Reducirajoče snovi, vključno z DTT in β-merkaptoetanolom, umetno povečajo absorbanco, ker same reducirajo baker, neodvisno od beljakovin. Kelatna sredstva, kot je EDTA, zmanjšajo absorbanco, saj vežejo baker, preden lahko reagira.

Kakšna je razlika med testoma BCA in Bradford? Bradford da rezultat v približno petih minutah, vendar ga motijo detergenti, reakcija pa se razlikuje glede na aminokislinsko sestavo beljakovine. BCA traja približno 30 minut, vendar prenaša detergente in daje bolj enakomerne meritve pri različnih beljakovinah, zato je primernejši za celične lizate.

Zakaj je izračunani volumen vzorca nenavadno velik? Velik volumen pomeni, da je izmerjena koncentracija beljakovin nižja od pričakovane. Pogosti vzroki so nepopolna liza celic, preveč razredčen vzorec ali meritev absorbance blizu spodnje meje zaznavanja testa. Koncentriranje vzorca s centrifugalnim filtrom ali prehod na izboljšani oziroma mikro BCA običajno odpravi težavo.

Kaj je treba storiti, če absorbanca pade zunaj linearnega območja? Vzorec razredčite in meritev ponovite. Razmerje med absorbanco in koncentracijo se nad približno 2,0 poruši, zato ekstrapolacija zunaj standardne krivulje podceni dejansko koncentracijo.

Viri

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT idr. »Measurement of protein using bicinchoninic acid.« Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85.
2. Thermo Fisher Scientific. »Pierce BCA Protein Assay Kit«, uporabniški priročnik (MAN0011430).
3. Bradford MM. »A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein.« Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.