Калкулатор растворљивости протеина - Бесплатни алат за pH и температуру

Калкулатор растворљивости протеина процењује највећу концентрацију протеина која остаје растворена у растварачу при задатом pH, температури и јонској јачини. Он основну хемију претвара у један број, изражен у милиграмима протеина по милилитру растварача.

Растворљивост протеина важна је у биохемији, формулацији лекова и науци о храни. Протеин који не остаје растворен ствара агрегате или талог, што може уништити експеримент или учинити лек непогодним за убризгавање.

Како израчунати растворљивост протеина

Растворљивост зависи од пет фактора: изоелектричне тачке протеина (pH при којем је његово укупно наелектрисање једнако нули), тачке топљења (температуре при којој почиње да се расклапа), диелектричне константе растварача (мере тога колико добро раздваја наелектрисане честице), pH вредности раствора и јонске јачине (мере количине растворене соли).

Калкулатор полази од познате растворљивости сваког протеина у води при референтним условима: 25 °C, pH 7,0 и јонској јачини од 0,15 M (приближно нивоу соли у крви). Затим ту референтну вредност множи са четири односа, по једним за сваки промењени услов.

Формула за растворљивост протеина

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ је позната растворљивост протеина у води при референтним условима, у mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, при чему је $pI$ изоелектрична тачка протеина. Растворљивост је најмања на изоелектричној тачки и расте како се pH удаљава од ње, при чему се уједначава унутар неколико pH јединица.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, при чему је $I$ јонска јачина у моловима по литру. При ниским концентрацијама соли овај члан благо повећава растворљивост („посољавање“). При високим концентрацијама соли смањује растворљивост („исољавање“).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, при чему је $T_m$ тачка топљења протеина у °C. Растворљивост постепено расте с температуром, а затим нагло опада када се температура приближи $T_m$ и протеин почне да се расклапа.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, при чему је $\varepsilon$ диелектрична константа растварача. Вода има диелектричну константу 78,4, па је овај члан у води једнак 1. Растварачи који мање ефикасно раздвајају наелектрисања од воде, као што је етанол, смањују растворљивост.

Референтне вредности које користи калкулатор

Категорије растворљивости

Пример: албумин у фосфатном пуферу

Одредите растворљивост албумина у фосфатном пуферу при 25 °C, pH 7,4 и јонској јачини од 0,15 M.

Референтне вредности за албумин су $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL и $T_m = 63°C$. Фосфатни пуфер има диелектричну константу 76,0.

1. pH члан: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Однос: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Јонски члан: јонска јачина (0,15 M) једнака је референтној вредности, па је однос 1.
3. Температурни члан: температура (25 °C) једнака је референтној вредности, па је однос 1.
4. Члан растварача: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Калкулатор даје резултат 492,12 mg/mL, што спада у категорију „веома растворљиво“.

Пример: лизозим у глицеролу при ниској температури

Одредите растворљивост лизозима у раствору глицерола при 4 °C, pH 5,0 и јонској јачини од 0,1 M. То су услови слични хладном складиштењу ензима.

Референтне вредности за лизозим су $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL и $T_m = 72°C$. Глицерол има диелектричну константу 42,5.

1. pH члан: прелазак са pH 7,0 на pH 5,0 (оба знатно испод pI вредности 11,35) само незнатно мења pH члан. Однос: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Јонски члан: смањење јонске јачине са 0,15 M на 0,1 M благо повећава растворљивост услед ефекта усољавања. Однос: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Температурни члан: хлађење са 25 °C на 4 °C, знатно испод тачке топљења, снижава овај члан. Однос: 0,8106.
4. Члан растварача: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Калкулатор даје резултат 35,88 mg/mL, што спада у категорију „растворљиво“. Ниска диелектрична константа глицерола, а не ниска температура, снижава резултат у односу на референтну вредност.

Како се користи калкулатор растворљивости протеина

1. Изаберите протеин са списка: албумин, инсулин, лизозим, хемоглобин, миоглобин, колаген, казеин или фибриноген.
2. Изаберите растварач: вода, фосфатни пуфер, Трис пуфер, глицерол, DMSO, метанол, етанол или ацетон.
3. Унесите температуру у °C (0 до 100), pH (0 до 14) и јонску јачину у моловима по литру (0 до 2).
4. Очитајте израчунату растворљивост у mg/mL и њену категорију. Трака испод резултата приказује вредност на скали од 0 до 100 mg/mL и попуњава се у потпуности при 100 mg/mL или више.

Шта утиче на растворљивост протеина

pH и изоелектрична тачка. Сваки протеин има изоелектричну тачку, pH при којем његова површина нема укупно електрично наелектрисање. При том pH, молекули протеина се међусобно не одбијају, па се групишу и лакше издвајају из раствора. Удаљавање pH вредности од изоелектричне тачке, у било ком смеру, даје протеину укупно наелектрисање. Наелектрисани молекули се међусобно одбијају, што их одржава раздвојеним и раствореним.

Јонска јачина. Растворени јони соли окружују наелектрисане групе на површини протеина. При ниским до умереним концентрацијама, ови јони заклањају наелектрисања која би иначе привлачила два молекула протеина, чиме повећавају растворљивост. То се назива посољавање. При високим концентрацијама соли, јони се такмиче с протеином за молекуле воде и уклањају слој воде који протеин одржава раствореним. То се назива исољавање и основа је уобичајене методе пречишћавања у којој се амонијум-сулфатом протеини таложе из смеше.

Температура. Загревање раствора обично повећава растворљивост, до одређене границе. Када се температура приближи тачки топљења протеина, протеин почиње да се расклапа. При томе се излажу хидрофобни (водоодбојни) делови протеина који су обично скривени у његовој савијеној структури. Ти изложени делови се међусобно лепе, изазивају агрегацију, па растворљивост нагло опада близу и изнад тачке топљења.

Растварач. Диелектрична константа растварача мери колико ефикасно он слаби електрично привлачење између наелектрисаних честица. Вода има високу диелектричну константу и добро раздваја наелектрисања, због чега се већина протеина боље раствара у води него у органским растварачима као што су етанол или ацетон. Растварачи с ниском диелектричном константом омогућавају да се супротна наелектрисања на различитим молекулима протеина јаче привлаче, што подстиче агрегацију.

Ограничења

Калкулатор користи поједностављен модел заснован на малом скупу референтних протеина и стандардних растварача. Он не узима у обзир чистоћу протеина, додатке као што су детерџенти или стабилизатори, нити необичне компоненте пуфера. Резултати су процене за планирање експеримената, а не замена за директно мерење растворљивости у лабораторији.

Најчешће постављана питања

Шта је растворљивост протеина? Растворљивост протеина је највећа концентрација протеина која остаје потпуно растворена у растварачу, без стварања видљивих агрегата или талога.

Зашто је растворљивост протеина најмања на његовој изоелектричној тачки? На изоелектричној тачки протеин нема укупно електрично наелектрисање, па се молекули протеина више не одбијају електрично. Без тог одбијања већа је вероватноћа да ће се слепити и издвојити из раствора.

Која је разлика између посољавања и исољавања? Посољавање се јавља при ниским концентрацијама соли, када растворени јони заклањају наелектрисане групе протеина једне од других и повећавају растворљивост. Исољавање се јавља при високим концентрацијама соли, када јони уклањају воду с површине протеина и смањују растворљивост.

Да ли виша температура увек повећава растворљивост? Не. Растворљивост обично расте с температуром само до одређене границе. Када се температура приближи тачки топљења протеина, протеин почиње да се расклапа, што обично изазива агрегацију и нагли пад растворљивости.

Зашто се протеини слабије растварају у етанолу или ацетону него у води? Вода има високу диелектричну константу, што значи да веома ефикасно слаби електрично привлачење између наелектрисаних делова молекула протеина. Етанол и ацетон имају ниже диелектричне константе, па се наелектрисане групе на различитим молекулима протеина у овим растварачима јаче привлаче, због чега је агрегација вероватнија.

Колико је овај калкулатор прецизан? Он даје процену засновану на физичком моделу и малом скупу референтних протеина и растварача. Користан је за сужавање услова које треба испитати, али експериментално мерење остаје једини начин да се потврди растворљивост одређеног узорка протеина.

Додатна литература

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Механизам усољавања и изсољавања протеина солима двовалентних катјона. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Мерење и повећање растворљивости протеина. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.