Hücre Seyreltme Hesaplayıcı - Doğru Laboratuvar Seyreltme Aracı

Hücre Seyreltme Hesaplayıcısı

Hücre seyreltme hesaplayıcısı, seçilen son hacimde hedef hücre konsantrasyonuna ulaşmak için ne kadar hücre süspansiyonu ile ne kadar seyrelticinin karıştırılması gerektiğini bulur. Hücre kültürü, mikrobiyoloji ve kullanımdan önce bir numunenin kesin bir konsantrasyona getirilmesi gereken diğer laboratuvar çalışmalarında kullanılır.

Hücre seyreltmesi ne anlama gelir?

Bir hücre süspansiyonunu seyreltmek, içerdiği hücre sayısını değiştirmez. Yalnızca hücrelerin bulunduğu hacmi değiştirir ve bu da konsantrasyonu düşürür. Mililitre başına 1.000.000 hücre (hücre/mL) olarak sayılan bir süspansiyon, seyreltmeden sonra da aynı toplam hücre sayısını içerir. Bu sayı yalnızca daha fazla sıvıya yayılır.

Laboratuvarlar birçok rutin işlemden önce hücreleri seyreltir: büyüyen bir kültürü yeni flasklara bölmek, bir plakanın her kuyusuna sabit sayıda hücre ekmek, hücreleri saklamak üzere dondurmak veya hücre sayacı ya da akış sitometresi için numune hazırlamak.

Hücre seyreltme formülü

Hesaplama tek bir kurala dayanır. Stok süspansiyonundan alınan hücre sayısı ile konsantrasyonunun çarpımı, son hacimdeki hücre sayısı ile hedef konsantrasyonunun çarpımına eşit olmalıdır:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — başlangıç (stok) konsantrasyonu, hücre/mL cinsinden
• V₁ — kullanılacak stok süspansiyonu hacmi, mL cinsinden
• C₂ — hedef konsantrasyon, hücre/mL cinsinden
• V₂ — gereken toplam son hacim, mL cinsinden

V₁ için çözüm, pipetlenecek stok süspansiyonu hacmini verir:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Son hacmin geri kalanı seyrelticidir; genellikle hücre kültürü besiyeri, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) veya başka bir tampondur:

Seyreltici hacmi = V₂ − V₁

Hedef konsantrasyon (C₂), stok konsantrasyonundan (C₁) hiçbir zaman yüksek olamaz. Seyreltme yalnızca konsantrasyonu düşürür. Konsantrasyonu artırmak için hücrelerin çöktürülmesi ve daha az sıvı içinde yeniden süspanse edilmesi gerekir.

Hücre seyreltmesi nasıl hesaplanır?

1. C₁ değerini elde etmek için stok süspansiyonunu hemositometre veya otomatik hücre sayacıyla sayın.
2. Protokolün gerektirdiği hedef konsantrasyonu, C₂, not edin.
3. Gereken toplam son hacmi, V₂, belirleyin.
4. V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ değerini hesaplayın.
5. Seyreltici hacmini V₂ − V₁ olarak hesaplayın.
6. V₁ stok süspansiyonunu bir tüpe pipetleyin, ardından besiyeri veya tamponun seyreltici hacmini ekleyin.

Çözümlü örnek

Bir stok süspansiyonu 1.000.000 hücre/mL olarak sayılmıştır. Bir protokol, 10 mL son hacimde 100.000 hücre/mL gerektirmektedir.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Seyreltici hacmi = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Stok süspansiyonundan 1 mL alınıp 9 mL besiyeri eklenmesi, 100.000 hücre/mL konsantrasyonunda 10 mL süspansiyon verir.

İkinci örnek

96 kuyucuklu bir plaka testi, kuyucuk başına 10.000 hücre ve kuyucuk başına 200 mikrolitre (μL) besiyeri gerektirir. Bu, hedef konsantrasyonun 50.000 hücre/mL olduğu anlamına gelir; çünkü 10.000 hücrenin 0,2 mL hacme bölünmesi 50.000 hücre/mL verir. Stok süspansiyonu 2.000.000 hücre/mL olarak sayılmıştır ve pipetleme kaybı için biraz fazlasıyla plakayı doldurmak üzere toplam 20 mL gereklidir.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Seyreltici hacmi = 20 − 0,5 = 19,5 mL

0,5 mL stok süspansiyonunun 19,5 mL besiyeriyle karıştırılması, 50.000 hücre/mL konsantrasyonunda 20 mL ve toplamda 1'e 40 seyreltme verir.

Hata kaynakları

Formülün kendisi kesindir. Hatalar, formüle girilen sayılardan kaynaklanır.

• Sayım hatası. Yanlış hücre sayımı doğrudan yanlış seyreltmeye yol açar. Hemositometre ızgarasındaki dört köşe karenin tamamını sayıp ortalamasını almak bu riski azaltır.
• Topaklanmış hücreler. Hücrelerden oluşan bir topak mikroskop altında tek hücre gibi görünür, ancak gerçekte birkaç hücreden oluşur; bu nedenle görünen konsantrasyonu düşürür.
• Pipet aralığı. Anma hacim aralığının dışında kullanılan bir pipet hatalı sonuç verir. 1000 μL'lik bir pipetin 5 μL verecek şekilde ayarlanması güvenilir değildir; bunun yerine daha küçük bir pipet kullanılmalıdır.
• Birim karışıklıkları. Hücre/mL ile hücre/μL birimlerinin karıştırılması, bin kat fazla veya az bir hataya yol açar.
• Ölü hücreler. Tripan mavisi gibi bir canlılık boyası kullanılmadıysa ham hücre sayımı ölü hücreleri de içerir. Bu durum, gerçekte mevcut olan canlı hücre sayısını olduğundan fazla gösterebilir.

Bu hesap makinesinin sınırları

Hesaplayıcı, anlamlı biçimde yanıtlayamayacağı sayıları reddeder:

• Her değer sıfırdan büyük olmalıdır.
• Hedef konsantrasyon başlangıç konsantrasyonundan yüksek olamaz.
• Başlangıç konsantrasyonu 1 trilyon hücre/mL (1 × 10¹²) veya daha düşük olmalıdır.
• Hesaplanan stok hacmi en az 0,001 mL, yani 1 mikrolitre olmalıdır. Bundan daha küçük hacimler doğru biçimde pipetlenemez; bu nedenle hesaplayıcı bunun yerine farklı sayılar ister. Toplam hacmi artırmak genellikle sorunu çözer.

Hacimler iki ondalık basamakla, stok hacmi 0,01 mL değerinin altındaysa üç ondalık basamakla gösterilir; böylece küçük bir hacim hiçbir zaman 0,00 mL olarak görünmez.

Sık sorulan sorular

Hücre seyreltme formülü nedir?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂; burada C₁ ve C₂ başlangıç ve hedef konsantrasyonlarını, V₁ ve V₂ ise stoktan alınan hacim ile toplam son hacmi ifade eder.

Hedef konsantrasyon başlangıç konsantrasyonundan yüksek olabilir mi?

Hayır. Seyreltme yalnızca konsantrasyonu düşürür. Daha yüksek bir konsantrasyona ulaşmak için hücrelerin santrifüjlenmesi ve daha küçük bir hacimde yeniden süspanse edilmesi gerekir.

Hücreleri seyreltmek için hangi sıvı kullanılmalıdır?

Hücrelerin saatlerce veya günlerce sağlıklı kalması gerektiğinde, örneğin bir plakaya ekimden önce, tam kültür besiyeri kullanılır. PBS veya benzer bir tamponlu tuzlu su, hücreler daha ileri işleme alınmadan önce yaklaşık 30 dakikadan kısa süreli seyreltmeler için uygundur. Serum proteinlerinin sonraki bir testi etkileyeceği durumlarda serum içermeyen besiyeri kullanılır.

Bu formül bakteriler veya mayalar için geçerli midir?

Evet. C₁V₁ = C₂V₂, koloni oluşturan birimler/mililitre (CFU/mL) cinsinden ölçülen bakteriler, mayalar ve plak oluşturan birim/mililitre (PFU/mL) cinsinden ölçülen viral partiküller dahil olmak üzere, denklemin her iki tarafında da aynı birimler kullanıldığı sürece her türlü partikül süspansiyonu için geçerlidir.

Seyreltme işleminde ölü hücreler sayılmalı mıdır?

Canlı bir kültür ekilecekse yalnızca canlı hücreler sayılmalıdır. Bir süspansiyonun canlılık oranı %80 ise canlı konsantrasyonu toplam hücre sayısının 0,8 katıdır ve bu canlı konsantrasyon C₁ olarak kullanılmalıdır.

Çok büyük seyreltmeler doğru biçimde nasıl yapılabilir?

1'e 1000 gibi büyük seyreltmeler genellikle seri seyreltme adı verilen bir dizi daha küçük adım halinde yapılır. Arka arkaya uygulanan üç 1'e 10 seyreltme, genel olarak 1'e 1000 seyreltmeye ulaşırken her pipetleme adımını doğru bir hacim aralığında tutar.