DNA Konsantrasyon Hesaplayıcı | A260'dan ng/μL'ye Dönüştürücü

DNA Konsantrasyonu Hesaplayıcı

DNA konsantrasyonu hesaplayıcısı, 260 nanometredeki UV absorbans ölçümünü, A260 olarak adlandırılan değeri, mikrolitre başına nanogram (ng/µL) cinsinden DNA konsantrasyonuna dönüştürür. Ayrıca bir örnekteki toplam DNA miktarını mikrogram (µg) cinsinden bildirir.

A260 absorbansı nedir?

A260, bir çözeltinin 260 nanometre dalga boyundaki ne kadar morötesi ışığı absorbe ettiğidir. DNA, nükleotit bazları nedeniyle UV ışığını en güçlü biçimde bu dalga boyunun yakınında absorbe eder. Spektrofotometre, örnekle aynı tampon kullanılarak yapılan kör ölçümün arka plan absorbansını çıkarmasından sonra A260 değerini ölçer. Çözeltideki DNA miktarı arttıkça A260 ölçümü de yükselir.

DNA konsantrasyonu formülü

Çift zincirli DNA, UV ışığını konsantrasyonuyla orantılı olarak absorbe eder; bu ilişki Beer-Lambert yasası olarak bilinir. 1 santimetrelik standart ışık yolunda, A260 ölçümü 1,0 olan bir çözelti yaklaşık 50 ng/µL çift zincirli DNA içerir. Dönüşüm katsayısı olan bu sayı, herhangi bir A260 ölçümünü konsantrasyona dönüştürür:

DNA konsantrasyonu (ng/µL) = A260 × 50 × seyreltme katsayısı

Seyreltme katsayısı, örnek ölçülmeden önce yapılan seyreltmeyi hesaba katar. Seyreltilmeden ölçülen bir örneğin seyreltme katsayısı 1 olur.

Toplam DNA verimi nasıl hesaplanır?

Konsantrasyon bilindiğinde, örnekteki toplam DNA kütlesi hacim üzerinden bulunabilir:

Toplam DNA (µg) = konsantrasyon (ng/µL) × hacim (µL) ÷ 1000

DNA konsantrasyonu nasıl hesaplanır: adım adım

1. Ölçümden önce örneği iyice karıştırın. DNA tüp duvarlarına yapışabilir veya eşit olmayan biçimde çökelebilir.
2. Örnek yüksek konsantrasyondaysa seyreltin ve A260 ölçümünü 0,1 ile 1,0 arasında tutmayı hedefleyin. Spektrofotometre ölçümleri bu aralığın dışında en az güvenilirliğe sahiptir.
3. Spektrofotometreyi seyreltme için kullanılan tamponla körleyin, ardından örneği 260 nm'de ölçün.
4. Konsantrasyonu ve toplam verimi elde etmek için A260 ölçümünü, örnek hacmini ve seyreltme katsayısını hesaplayıcıya girin. Bir sonuç görüntülenmeden önce üç kutunun da doldurulması ve hacmin sıfırdan büyük olması gerekir.

Uygulamalı örnek

Örnek 1: seyreltilmemiş örnek

A260 ölçümü 0,5, seyreltme yok (seyreltme katsayısı 1) ve örnek hacmi 100 µL.

• Konsantrasyon = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Toplam DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Örnek 2: seyreltilmiş örnek

Bir tüpte 50 µL saflaştırılmış DNA bulunur. Bunun küçük bir kısmı 10 kat seyreltilmiş ve seyreltilen kısımda A260 ölçümü 0,75 olarak elde edilmiştir. Seyreltme katsayısı, bu ölçümü ilk tüpteki konsantrasyona geri dönüştürür; toplam verim adımı için girilen hacim ise 50 µL olur.

• Konsantrasyon = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Toplam DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Seyreltme katsayısının hesaplanması

Seyreltme katsayısı = seyreltme sonrasındaki toplam hacim ÷ ilk örneğin hacmi.

5 µL DNA çözeltisinin 45 µL tampona eklenmesi, toplam hacmi 50 µL yapar; dolayısıyla seyreltme katsayısı 50 ÷ 5 = 10 olur. Seyreltilmemiş bir örneğin seyreltme katsayısı 1 olur.

Tipik DNA konsantrasyonu aralıkları

Konsantrasyon, örnek türüne ve ekstraksiyon yöntemine bağlıdır. Genomik DNA ekstraksiyonlarında konsantrasyon genellikle yaklaşık 10 ile 100 ng/µL arasında olur. Plazmit DNA hazırlamaları çoğu zaman daha yüksek konsantrasyonlar verir; bu değer bazen birkaç yüz ng/µL olabilir. Belirli bir yöntem için beklenen aralığın çok dışındaki bir sonuç, ekstraksiyonda veya ölçümün kendisinde bir sorun olduğunu gösterebilir.

UV absorbans ölçümünün sınırları

A260 ölçümü hızlıdır, ancak DNA için en duyarlı veya en özgül yöntem değildir. Proteinler, RNA ve bazı tampon bileşenleri de 260 nm civarında ışığı absorbe ederek ölçümü olduğundan yüksek gösterebilir. Bilim insanları, protein kontaminasyonunu taramak için konsantrasyonun yanı sıra genellikle A260/A280 oranını da kontrol eder; 1,8 civarındaki bir oran genellikle saf bir DNA örneğine işaret eder. Qubit testleri gibi floresan boya temelli yöntemler yalnızca çift zincirli DNA'ya bağlanır ve seyreltik veya saf olmayan örneklerde daha doğru ölçüm sağlar; ancak ek reaktifler ve bir florometre gerektirir.

Sık sorulan sorular

A260 değerinden DNA konsantrasyonu nasıl hesaplanır?

A260 ölçümünü, çift zincirli DNA için standart dönüşüm katsayısı olan 50 ile çarpın, ardından seyreltme katsayısıyla çarpın. Örnek seyreltilmemişse seyreltme katsayısı olarak 1 kullanın.

İyi bir A260/A280 oranı nedir?

1,8 civarındaki bir oran genellikle saf bir DNA örneğine işaret eder. Daha düşük bir oran protein kontaminasyonunu düşündürür. 2,0 üzerindeki bir oran RNA kontaminasyonuna işaret edebilir.

Bu hesaplayıcı RNA için kullanılabilir mi?

Doğrudan kullanılamaz; çünkü RNA, 50 yerine 40 ng/µL dönüşüm katsayısını kullanır. RNA konsantrasyonunu tahmin etmek için hesaplayıcının sonucunu 0,8 ile (40 ÷ 50) çarpın veya doğrudan A260 × 40 × seyreltme katsayısını kullanın.

A260 ölçümü neden 0,1 ile 1,0 arasında olmalıdır?

Absorbans, Beer-Lambert yasasında açıklanan biçimde, esas olarak bu aralıkta konsantrasyonla yaklaşık orantılı kalır. Bu aralığın dışında ölçümler daha az güvenilir hâle gelir; bu nedenle fazla konsantre veya fazla seyreltik bir örnek yeniden ölçülmeden önce seyreltilmeli veya konsantre edilmelidir.

Konsantrasyon ile saflık arasındaki fark nedir?

Konsantrasyon, ne kadar DNA bulunduğunu ng/µL cinsinden ölçer. Saflık, esas olarak A260/A280 gibi absorbans oranlarına göre değerlendirilen örneğin ne kadar temiz olduğunu gösterir. Bir örnek yüksek konsantrasyona sahip olup yine de saf olmayabilir veya düşük konsantrasyona sahip olup çok saf olabilir.

ng/µL nasıl µg/mL'ye dönüştürülür?

İki birim sayısal olarak eşittir. 1 ng/µL, 1 µg/mL'ye eşittir; çünkü kütle birimi ve hacim birimi ayrı ayrı 1000 katsayısıyla ölçeklenir.

Kaynaklar

1. Sambrook, J. ve Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. baskı). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R. ve Desjardins, P. R. (2006). Absorpsiyon ve floresans spektroskopisiyle DNA ve RNA miktar tayini. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Nükleik asitlerin saflığının ölçümünde A260/A280 oranlarının değeri. BioTechniques, 19(2), 208–210.