Protein Konsantrasyon Hesaplayıcı | A280'den mg/mL'ye

Protein konsantrasyonu hesaplayıcı

Protein konsantrasyonu hesaplayıcı, spektrofotometreden alınan ışık absorbansı değerini bir çözeltide çözünmüş protein miktarına dönüştürür. Sonuç genellikle mililitre başına miligram (mg/mL) veya mililitre başına mikrogram (μg/mL) cinsinden verilir. Hesaplama, kimyada bir örneğin ne kadar ışık absorbe ettiğini içerdiği madde miktarıyla ilişkilendiren Beer-Lambert yasasına dayanır.

Protein konsantrasyonu nasıl ölçülür?

Proteinlerin çoğu, 280 nanometre (nm) dalga boyundaki morötesi ışığı güçlü biçimde absorbe eder. Bu absorbsiyonun temel nedeni, proteinin yapısında bulunan iki amino asit olan triptofan ve tirozindir. Spektrofotometre, örneğin içinden ışık geçirir ve örneğin bunun ne kadarını absorbe ettiğini ölçer. Bu ölçüm absorbans olarak adlandırılır; 280 nm'de alındığında A280 olarak gösterilir.

280 nm'de absorbans ölçümü hızlıdır ve örneği yok etmez. Bu yönüyle aşağıda açıklanan Bradford veya BCA testi gibi kimyasal yöntemlerden ayrılır. Yöntem, çözeltideki saflaştırılmış bir protein üzerinde, yaklaşık 0,1 ile 1,0 arasındaki absorbans değerlerinde en iyi sonucu verir. Bu aralığın dışındaki ölçümler daha az güvenilirdir; bu nedenle ölçümden önce örneğin seyreltilmesi gerekebilir.

Protein konsantrasyonu formülü

Hesaplayıcı, konsantrasyonu bulmak için Beer-Lambert yasasını yeniden düzenler:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — mg/mL cinsinden protein konsantrasyonu
• A — 280 nm'de absorbans (birimsiz yalın sayı)
• DF — seyreltme faktörü; ölçülmeden önce başlangıç örneğinin kaç kat seyreltildiği
• ε — proteine özgü bir sabit olan sönüm katsayısı; L/(g·cm) cinsinden
• l — ışığın örnek içinden katettiği mesafe olan optik yol uzunluğu; cm cinsinden (spektrofotometrede kullanılan küçük cam veya plastik kap olan standart bir küvette genellikle 1 cm)

Sonucu mililitre başına mikrograma dönüştürmek için mg/mL değerini 1.000 ile çarpın. Örnekteki toplam protein kütlesini bulmak için konsantrasyonu örnek hacmiyle (mililitre cinsinden) çarpın.

Çözümlü örnek

Bir örnek, 280 nm'de 0,5 absorbans değeri verir. Örnek seyreltilmediğinden seyreltme faktörü 1'dir ve ölçüm standart 1 cm'lik bir küvette yapılmıştır. Protein, ekstinksiyon katsayısı 0,667 L/(g·cm) olan sığır serum albüminidir (BSA).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

1 mL'lik bir örnekte bu, yaklaşık 0,75 mg toplam proteine veya 750 μg/mL'ye karşılık gelir.

Yaygın proteinler için sönüm katsayıları

Her protein, farklı sayıda triptofan ve tirozin kalıntısına sahip olduğu için ışığı farklı biçimde absorbe eder. Sönüm katsayısı, belirli bir proteinin 280 nm'deki bu özelliğini L/(g·cm) birimiyle tanımlar. Yaygın olarak kullanılan bazı değerler şunlardır:

Hesaplayıcı, bu listede bulunmayan bir protein için özel bir sönüm katsayısını da kabul edebilir. Amino asit dizisi bilinen bir protein için bu değer, Gill ve von Hippel tarafından 1989 yılında yayımlanan şu formülle tahmin edilebilir: ε₂₈₀ = (triptofan kalıntıları × 5.500) + (tirozin kalıntıları × 1.490) + (sistin kalıntıları × 125). Bu formül, molar birim olan M⁻¹cm⁻¹ cinsinden sonuç verir; bu birim, yukarıdaki kütle temelli L/(g·cm) değerlerinden farklıdır. ExPASy sunucusunda barındırılan ProtParam gibi ücretsiz araçlar, bu değeri doğrudan bir protein dizisinden hesaplar.

Optik yol uzunluğu ve seyreltme faktörü

Optik yol uzunluğu, örneği tutan küvetin santimetre cinsinden ölçülen genişliğidir. Standart küvetlerin genişliği 1 cm'dir. Çok küçük örnekleri ölçen mikro hacimli spektrofotometreler, 0,1 cm gibi çok daha kısa bir optik yol kullanabilir.

Seyreltme faktörü, ölçümden önce yapılan seyreltmeyi hesaba katar. Konsantre bir örnek 1,0 değerinin üzerinde absorbans verecekse, örneğin önce tamponla seyreltilmesi yaygın bir uygulamadır. Seyreltme faktörü, toplam seyreltilmiş hacmin başlangıç örneği hacmine bölünmesine eşittir. Örneğin 10 μL örneğin 990 μL tamponla karıştırılması, toplam 1.000 μL hacim ve 100 seyreltme faktörü verir.

Protein konsantrasyonunu ölçmenin diğer yolları

280 nm'deki absorbans, laboratuvarda kullanılan yaygın yöntemlerden biridir.

• Bradford testi: Proteine bağlandığında renk değiştiren bir boya kullanır. Saflaştırılmamış örneklerde iyi çalışır, ancak renk değişimi farklı proteinler arasında değişiklik gösterebilir.
• BCA testi: Proteinin peptit bağlarının neden olduğu renk değişimine dayanır. Birçok deterjanla uyumludur, ancak doğrudan absorbans ölçümüne göre uygulanması daha uzun sürer.
• Lowry yöntemi: Çok duyarlı olan eski bir yöntemdir, ancak bazı yaygın tampon bileşenleriyle iyi tepkime vermez.

Bu üç yöntemin her biri örneği yok eder. Doğrudan A280 ölçümü örneği yok etmediğinden, aynı örnek geri kazanılıp yeniden kullanılabilir.

Sık sorulan sorular

Bu yöntem için ideal absorbans aralığı nedir?

0,1 ile 1,0 arasındadır. 0,1 değerinin altında ölçüm kesin değildir. 1,0 değerinin üzerinde absorbans ile konsantrasyon arasındaki ilişki artık doğrusal olmayabilir; bu nedenle örnek önce seyreltilmelidir.

Neden 260 nm yerine 280 nm'de ölçüm yapılır?

DNA ve RNA gibi nükleik asitler 260 nm'de güçlü biçimde absorbe eder. Proteinler, triptofan ve tirozin içerikleri nedeniyle 280 nm'de daha fazla absorbe eder. 280 nm'de ölçüm yapmak, örnekte bulunan nükleik asitlerin neden olduğu girişimi azaltır.

Listelenmeyen bir protein için sönüm katsayısı nasıl bulunur?

Dizisi bilinen bir protein için ProtParam gibi bir araç, sönüm katsayısını triptofan, tirozin ve sistin kalıntılarının sayısından hesaplar. Katsayı, örneğin absorbansı bilinen konsantrasyondaki bir çözeltinin absorbansıyla karşılaştırılarak doğrudan da ölçülebilir.

Bu yöntem protein karışımı için çalışır mı?

Bu yöntem, bilinen sönüm katsayısına sahip tek ve saflaştırılmış bir protein için en iyi sonucu verir. Hücre lizatı gibi bilinmeyen proteinlerden oluşan bir karışım genellikle bunun yerine Bradford veya BCA testiyle ölçülür; çünkü bu yöntemler toplam protein için daha tutarlı bir tahmin sağlar.

Deterjanlar ölçümü etkileyebilir mi?

Evet. Birçok deterjan 280 nm yakınında ışığı absorbe eder ve bu durum sonucu bozabilir. Aynı deterjan konsantrasyonunu içeren kör bir örnek kullanmak, bu arka plan absorbansının etkisini gidermeye yardımcı olur. Çok yüksek deterjan konsantrasyonlarında bunun yerine BCA gibi deterjanlarla uyumlu bir test gerekebilir.