Перейти до вмісту
🛠️
Whiz Tools

Калькулятор об'єму зразка BCA | Інструмент кількісної оцінки білка

Миттєво розраховуйте об'єми зразків за показаннями абсорбції BCA. Отримайте точні об'єми навантаження білка для вестерн-блотів, ферментних аналізів та IP-експериментів.

Калькулятор об'єму зразка за поглинанням BCA

Розрахуйте точні об'єми зразків за показниками поглинання BCA та цільовою масою білка. Введіть значення поглинання та бажану кількість білка для отримання точних об'ємів для послідовного навантаження.

Налаштування стандартної кривої

Тип стандартної кривої
Крива стандарту BCA
Візуалізація кривої стандарту BCA0.0000.5001.0001.5002.0002.500Концентрація білка (мкг/мкл)00.511.522.5Абсорбція (A562)

Вхідні дані зразка

Зразок 1

Об'єм зразка
—μL

Підсумок результатів

Назва зразкаПоглинанняМаса зразка (мкг)Концентрація білка (мкг/мкл)Об'єм зразка (мкл)
Зразок 1————

Формула розрахунку

Об'єм зразка розраховується за наступною формулою:

Об'єм зразка (мкл) = Маса зразка (мкг) / Концентрація білка (мкг/мкл)
Поради з використання

• Підтримуйте поглинання в межах 0,1-2,0 для точних результатів у лінійному діапазоні

• Типові кількості: 20-50 мкг для вестерн-блоту, 500-1000 мкг для імунопреципітації

• Об'єми понад 1000 мкл вказують на низьку концентрацію білка — розгляньте концентрування зразка

• Стандартний BCA підходить для більшості застосувань (20-2000 мкг/мл). Використовуйте покращений для розведених зразків (5-250 мкг/мл)

Калькулятор завантаження...
📚

Документація

Швидкий калькулятор об'єму зразка BCA для кількісного визначення білка

Коли ви щойно завершили проведення аналізу BCA і вам потрібно визначити, скільки зразка завантажити для вестерн-блоту, ви стикаєтеся з розрахунком, який простий за принципом, але громіздкий на практиці. Виміряйте поглинання при 562 нм, порівняйте з вашою стандартною кривою, розрахуйте концентрацію білка, а потім визначте необхідний об'єм для бажаної маси білка.

Цей калькулятор миттєво виконує ці математичні обчислення. Введіть показання поглинання BCA та цільову кількість білка — ви отримаєте точний об'єм зразка в мікролітрах. Особливою перевагою BCA-аналізів є їх стійкість до детергентів і сурфактантів, які могли б перешкоджати методам Бредфорда або Лоурі. Коли ви працюєте з лізатами клітин, що містять SDS або Тритон X-100, BCA залишається точним, тоді як інші методи зазнають невдачі.

Як працює кількісне визначення білка за методом БЦА

Принцип аналізу БЦА

Аналізи БЦА (біцинхонінової кислоти) працюють через двоступеневу мідну реакцію. Білки відновлюють Cu²⁺ до Cu¹⁺ в лужних умовах — ступінь відновлення безпосередньо корелює з концентрацією білка. Саме тут на допомогу приходить біцинхонінова кислота: вона зв'язується з Cu¹⁺, утворюючи інтенсивний фіолетовий комплекс, який поглинає світло при 562 нм.

Ви вимірюєте цей фіолетовий колір за допомогою спектрофотометра. Чим темніший фіолетовий, тим більше білка. Порівняйте поглинання вашого зразка зі стандартною кривою (зазвичай використовуючи стандарти БСА), і ви отримаєте концентрацію білка. Перевага БЦА полягає в тому, що він надійно працює навіть за наявності детергентів, відновлюючих цукрів або інших поширених компонентів буфера — речовин, які могли б зіпсувати аналізи Бредфорда або Лоурі.

Формула для розрахунку об'єму зразка

Основна формула для розрахунку об'єму зразка з результатів поглинання БЦА:

Об’єм зразка (мкл)=Маса зразка (мкг)Концентрація білка (мкг/мкл)\text{Об'єм зразка (мкл)} = \frac{\text{Маса зразка (мкг)}}{\text{Концентрація білка (мкг/мкл)}}

Де:

  • Об'єм зразка — необхідний об'єм зразка (у мікролітрах, мкл)
  • Маса зразка — бажана кількість білка для використання (у мікрограмах, мкг)
  • Концентрація білка — отримана з показників поглинання БЦА (у мкг/мкл)

Концентрація білка розраховується з показників поглинання за допомогою рівняння стандартної кривої:

Концентрація білка (мкг/мкл)=Нахил×Поглинання+Перетин\text{Концентрація білка (мкг/мкл)} = \text{Нахил} \times \text{Поглинання} + \text{Перетин}

Для стандартного аналізу БЦА типовий нахил становить приблизно 2,0, а перетин часто близький до нуля, хоча ці значення можуть варіюватися залежно від конкретних умов аналізу та стандартної кривої. Згідно з протоколами Методів у ензимології, побудова стандартної кривої принаймні з 5-6 точками, що охоплюють очікуваний діапазон концентрацій, забезпечує точну кількісну оцінку для різних типів білків.

Використання калькулятора об'єму зразка BCA

Калькулятор спрощує те, що інакше вимагало б ручного обчислення для кожного зразка:

  1. Введіть свої вимірювання:

    • Позначте свій зразок (корисно при обчисленні об'ємів для кількох зразків одночасно)
    • Введіть показання абсорбції з вашого спектрофотометра при 562 нм
    • Вкажіть, скільки білка вам потрібно в мікрограмах (зазвичай 10-50 мкг для вестерн-блотів, 500-1000 мкг для імунопреципітації)

  2. Виберіть тип стандартної кривої:

    • Стандартний BCA: Найпоширеніший протокол, працює в діапазоні 20-2000 мкг/мл
    • Посилений BCA: Підвищена чутливість для розведених зразків (5-250 мкг/мл)
    • Мікро BCA: Формат мікропластини при обмеженому об'ємі зразка
    • Власний: Введіть власний нахил і перетин, якщо ви створили іншу стандартну криву

  3. Отримайте об'єм зразка:

    • Калькулятор миттєво показує, скільки мікролітрів потрібно піпетувати
    • Додайте кілька зразків, щоб розрахувати цілу пластину одночасно
    • Скопіюйте результати безпосередньо до лабораторного журналу або LIMS

Реальний приклад

Припустимо, ви готуєте зразки для вестерн-блоту для порівняння експресії білка в шести клітинних лініях. Ви проводите аналіз BCA, і один зразок дає показання абсорбції 0,75. Вам потрібно 20 мкг білка на доріжку.

Використовуючи стандартну криву (нахил = 2,0, перетин = 0):

  • Концентрація білка = 2,0 × 0,75 + 0 = 1,5 мкг/мкл
  • Необхідний об'єм зразка = 20 мкг ÷ 1,5 мкг/мкл = 13,33 мкл

Піпетуйте 13,33 мкл цього зразка, додайте буфер для нанесення, і у вас рівно 20 мкг білка. Водночас, зразок з абсорбцією 1,2 потребуватиме лише 8,33 мкл для тих самих 20 мкг. Калькулятор усуває необхідність працювати через ці обчислення для кожного зразка — просто введіть свої показання та отримайте всі об'єми одразу.

Розуміння результатів

Калькулятор надає кілька важливих відомостей:

  1. Концентрація білка: Розраховується з вашого показання абсорбції з використанням обраної стандартної кривої. Представляє кількість білка на одиницю об'єму у вашій пробі (мкг/мкл).

  2. Об'єм проби: Це об'єм вашої проби, що містить бажану кількість білка. Це значення ви будете використовувати при підготовці експериментів.

  3. Попередження та рекомендації: Калькулятор може надавати попередження для:

    • Дуже високих показань абсорбції (>3,0), які можуть бути поза лінійним діапазоном аналізу
    • Дуже низьких показань абсорбції (<0,1), які можуть бути близькими до межі виявлення
    • Розрахованих об'ємів, які є практично занадто великими (>1000 мкл) або занадто малими (<1 мкл)

Практичні застосування в лабораторії

Підготовка зразків для вестерн-блоту

Неоднорідне навантаження білка є однією з найпоширеніших причин, чому вестерн-блоти не дають надійних результатів. Ви можете побачити яскраві смуги в одній доріжці та слабкі смуги в іншій — не через відмінності в рівнях експресії, а через різну кількість загального білка.

Вирішення є простим, але вимагає точних об'ємних розрахунків. Після отримання показників абсорбції BCA для всіх зразків визначте, скільки білка завантажити в доріжку (зазвичай я використовую 20-30 мкг для рясних білків, до 50 мкг для менш рясних мішеней). Розрахуйте необхідний об'єм для кожного зразка, потім нормалізуйте, доводячи всі зразки до однакового кінцевого об'єму лізисним буфером перед додаванням буфера Лаеммлі.

Поширена помилка: забування про те, що об'єм зразка змінюється після додавання навантажувального буфера. Якщо ви завантажуєте 15 мкл загального об'єму, а ваш навантажувальний буфер у 4 рази концентрованіший, вам потрібно 3,75 мкл буфера та 11,25 мкл розведення зразка. Плануйте розведення відповідно.

Ферментативні аналізи

Вимірювання кінетики ферментів вимагає послідовної кількості білка в репліках та умовах. При порівнянні активності ферментів між різними обробками клітин або тканинними зразками вам потрібно знати, що ви починаєте з однакової кількості загального білка — інакше відмінності в активності можуть просто відображати відмінності в концентрації ферменту.

Для ферментативних аналізів я зазвичай працюю з меншою кількістю білка, ніж у вестерн-блотах — часто 5-10 мкг на реакцію для рясних ферментів. Ключовим є підтримання цієї послідовності у всіх умовах та часових точках.

Експерименти з імунопреципітації

IP-експерименти можуть споживати значну кількість білка — зазвичай 500-1000 мкг загального лізату на реакцію. Коли ви осаджуєте малорясний білок або тестуєте кілька антитіл, ви можете обробити понад десяток IP в одному експерименті.

Початок з нерівної кількості білка руйнує весь ваш експеримент. Якщо один зразок має 800 мкг вхідного матеріалу, а інший — 1200 мкг, ви не зможете змістовно порівняти кількість співосаджених білків. Розрахуйте необхідний об'єм для кожного лізату, нормалізуйте до однакового загального об'єму лізисним буфером, потім продовжуйте інкубацію з антитілами. Це забезпечує, що будь-які відмінності, які ви побачите у вестерн-блоті, відображають реальні біологічні відмінності, а не варіації вихідного матеріалу.

Очищення білка

Відстеження концентрації білка протягом етапів очищення є суттєвим для розрахунку виходу та визначення фракцій, що містять цільовий білок. Зазвичай ви проводите BCA-аналізи фракцій колонки, щоб ідентифікувати піки та оцінити ефективність очищення.

Корисним є розрахунок загального білка в кожній фракції (концентрація × об'єм) для відстеження відновлення через схему очищення. Якщо ви починаєте з 500 мг загального білка в лізаті та закінчуєте 2 мг очищеного білка з чистотою 95%, ви відновили 0,4% загального білка, але значно збагатили цільовий білок. Ці розрахунки спрямовують оптимізацію протоколу очищення.

Розширені функції та міркування

Власні стандартні криві

Незважаючи на те, що калькулятор надає параметри за замовчуванням для стандартних BCA аналізів, ви також можете вводити власні значення, якщо створили власну стандартну криву. Це особливо корисно, коли:

  • Працюєте з нестандартними білковими зразками
  • Використовуєте модифіковані BCA протоколи
  • Працюєте в присутності речовин, які можуть заважати аналізу

Щоб використати власну стандартну криву:

  1. Виберіть "Власна" з параметрів стандартної кривої
  2. Введіть значення нахилу та перетину
  3. Калькулятор використає ці значення для всіх подальших розрахунків

Робота з декількома зразками

Калькулятор дозволяє додавати декілька зразків і одночасно розраховувати їх об'єми. Це особливо корисно при підготовці зразків для експериментів, які вимагають послідовного навантаження білка за різних умов.

Переваги пакетної обробки:

  • Заощадження часу шляхом одночасного розрахунку всіх об'ємів
  • Забезпечення послідовності для всіх зразків
  • Легке порівняння концентрацій білка між зразками
  • Виявлення викидів або потенційних помилок вимірювання

Усунення поширених проблем

Поглинання поза лінійним діапазоном

Показники поглинання вище 2,0 зазвичай виходять за межі лінійного діапазону більшості стандартних BCA кривих. Це трапляється з дуже концентрованими зразками — очищеними білками, ядерними екстрактами або неправильно розведеними лізатами.

Рішення просте: розведіть зразок у співвідношенні 1:5 або 1:10 у воді або лізисному буфері, повторно проведіть BCA аналіз і помножте розраховану концентрацію на коефіцієнт розведення. Не намагайтеся екстраполювати за межі лінійного діапазону стандартної кривої — зв'язок між поглинанням і концентрацією порушується при високих концентраціях, що призводить до заниження рівня білка.

Низьке поглинання біля меж виявлення

Коли поглинання падає нижче 0,1, точність вимірювання стає проблематичною. Ви наближаєтесь до нижньої межі виявлення, де невеликі варіації показників поглинання перетворюються на значні варіації розрахованої концентрації.

Для розведених зразків розгляньте можливість переходу на розширені або мікро BCA протоколи, які забезпечують кращу чутливість. Як альтернативу, концентруйте зразок за допомогою центрифужних фільтрів (Amicon або подібних). В крайньому разі, скоригуйте експериментальний дизайн для роботи з меншою кількістю білка — багато застосувань допускають менше навантаження, ніж ви можете очікувати.

Розрахунки об'ємів, які не мають сенсу

Калькулятор може запропонувати піпетувати 150 мкл, коли максимальна місткість лунки становить 30 мкл. Або він пропонує 0,8 мкл, що нижче діапазону точного піпетування для більшості мікропіпеток.

Для великих об'ємів: концентруйте зразок за допомогою центрифужних фільтрів або методів осадження (TCA або ацетонове осадження). Для дуже малих об'ємів: або розведіть зразок (потім використовуйте пропорційно більший об'єм), або зменшіть цільову кількість білка, якщо експеримент дозволяє.

Еволюція методів кількісного визначення білків

Кількісне визначення білків пройшло довгий шлях від методу Кьєльдаля 1883 року, який вимагав розкладання зразків у киплячій сірчаній кислоті для вимірювання вмісту азоту. Лабораторіям були потрібні спеціалізоване обладнання та значний досвід, щоб лише оцінити концентрацію білка.

Як ми дійшли до сучасних BCA-аналізів

Біуретний тест (початок 1900-х) приніс колориметричний аналіз у кількісне визначення білків. Пептидні зв'язки комплексуються з іонами міді в лужному розчині, утворюючи фіолетовий колір. Простий, але не надто чутливий.

Олівер Лоурі вдосконалив це у 1951 році, поєднавши біуретну реакцію з реагентом Фоліна-Чокальтеу. Аналіз Лоурі домінував у кількісному визначенні білків протягом десятиліть, але мав критичний недолік: численні поширені лабораторні хімікати заважали реакції — миючі засоби, ЕДТА, навіть високі концентрації солей могли спотворити вимірювання.

Метод Меріон Бредфорд 1976 року з використанням Кумасі Брильянт Блю G-250 пропонував швидкість — результати за 5 хвилин замість 30 — але мав власні проблеми. Барвник переважно зв'язується з основними амінокислотами, тому склад білка суттєво впливає на показання. Більш критично, миючі засоби в концентраціях, що використовуються при лізисі клітин, повністю порушують аналіз.

На зміну прийшов BCA-аналіз у 1985 році. Пол Сміт та колеги з Pierce Chemical Company усвідомили, що біцинхонінова кислота може виявляти іони Cu¹⁺ більш чутливо, ніж традиційні біуретні реагенти. Їхня інновація поєднала толерантність біуретної хімії до різних буферних компонентів з підвищеною чутливістю, створивши метод, що надійно працює навіть у присутності миючих засобів, відновлюючих цукрів та інших речовин, які заважають аналізам Бредфорда або Лоурі. Саме тому BCA став стандартом для кількісного визначення білків з клітинних лізатів — він працює з реальними умовами зразків.

Приклади коду для обчислення об'єму проби

Формула Excel

1=IF(B2<=0,"Помилка: Недійсне поглинання",IF(C2<=0,"Помилка: Недійсна маса проби",C2/(2*B2)))
2
3' Де:
4' B2 містить показник поглинання
5' C2 містить бажану масу проби в мкг
6' Формула повертає необхідний об'єм проби в мкл
7

Реалізація на Python

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """Обчислити концентрацію білка з поглинання за стандартною кривою."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("Поглинання не може бути від'ємним")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """Обчислити необхідний об'єм проби на основі поглинання та бажаної маси."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("Маса проби має бути додатньою")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("Обчислена концентрація білка має бути додатньою")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# Приклад використання
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # мкг
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"Для поглинання {absorbance} та бажаної маси білка {sample_mass} мкг:")
31    print(f"Концентрація білка: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} мкг/мкл")
32    print(f"Необхідний об'єм проби: {volume:.2f} мкл")
33except ValueError as e:
34    print(f"Помилка: {e}")
35

Код R для аналізу

1# Функція для обчислення концентрації білка з поглинання
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("Поглинання не може бути від'ємним")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Функція для обчислення об'єму проби
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("Маса проби має бути додатньою")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("Обчислена концентрація білка має бути додатньою")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Приклад використання
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # мкг
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("Для поглинання %.2f та бажаної маси білка %.2f мкг:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("Концентрація білка: %.2f мкг/мкл\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("Необхідний об'єм проби: %.2f мкл\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("Помилка: %s\n", e$message))
39})
40

Реалізація на JavaScript

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("Поглинання не може бути від'ємним");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("Маса проби має бути додатньою");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("Обчислена концентрація білка має бути додатньою");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Приклад використання
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // мкг
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`Для поглинання ${absorbance} та бажаної маси білка ${sampleMass} мкг:`);
33  console.log(`Концентрація білка: ${proteinConcentration.toFixed(2)} мкг/мкл`);
34  console.log(`Необхідний об'єм проби: ${volume.toFixed(2)} мкл`);
35} catch (error) {
36  console.error(`Помилка: ${error.message}`);
37}
38

Стандартна крива візуалізації

Зв'язок між поглинанням та концентрацією білка зазвичай є лінійним у певному діапазоні. Нижче наведено візуалізацію стандартної кривої BCA:

Стандартна крива BCA для кількісного визначення білка Візуалізація лінійного зв'язку між поглинанням та концентрацією білка в аналізі BCA 0.0 
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
0.0 
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

Поглинання (562 нм) Концентрація білка (мкг/мкл)

Стандартна крива Стандартні зразки

Стандартна крива BCA

Порівняння з іншими методами кількісного визначення білка

Різні методи кількісного визначення білка мають різні переваги та обмеження. Ось як BCA-аналіз порівнюється з іншими поширеними методами:

МетодДіапазон чутливостіПеревагиОбмеженняНайкраще підходить для
BCA-аналіз5-2000 мкг/мл• Сумісний з детергентами
• Менша варіація між білками
• Стабільний розвиток кольору		• Заважають відновлюючі агенти
• Впливають деякі хелатуючі агенти		• Загальне кількісне визначення білка
• Зразки, що містять детергенти
Метод Бредфорда1-1500 мкг/мл• Швидкий (2-5 хв)
• Мало заважаючих речовин		• Висока варіація між білками
• Несумісний з детергентами		• Швидкі вимірювання
• Зразки без детергентів
Метод Лоурі1-1500 мкг/мл• Добре встановлений
• Хороша чутливість		• Багато заважаючих речовин
• Багатоступеневий		• Історична послідовність
• Чисті білкові зразки
УФ-поглинання (280 нм)20-3000 мкг/мл• Недеструктивний
• Дуже швидкий
• Не потребує реактивів		• Впливають нуклеїнові кислоти
• Вимагає чистих зразків		• Чисті білкові розчини
• Швидкі перевірки під час очищення
Флуорометричний0,1-500 мкг/мл• Найвища чутливість
• Широкий динамічний діапазон		• Дорогі реактиви
• Вимагає флуорометра		• Дуже розведені зразки
• Обмежений об'єм зразка

Часто запитувані питання

Для чого використовується аналіз BCA?

Аналізи BCA кількісно визначають загальну концентрацію білка у зразках. Ви будете використовувати його щоразу, коли вам потрібно знати, скільки білка у вас є — перед вестерн-блотингом для забезпечення рівномірного навантаження, перед ферментними аналізами для нормалізації показників активності, під час очищення білка для відстеження виходу або при підготовці зразків для мас-спектрометрії. Він став стандартним методом кількісного визначення білка в більшості лабораторій молекулярної біології та біохімії, оскільки витримує присутність детергентів і компонентів буфера у типових клітинних лізатах.

Наскільки точним є аналіз BCA?

За хороших умов очікуйте точність 5-10%. Це залежить від побудови правильної стандартної кривої (принаймні 5-6 точок, що охоплюють очікуваний діапазон концентрацій), використання свіжих реактивів та відсутності заважаючих речовин у високих концентраціях. Склад білка має значення — колаген і желатин дають незвично високі показання через склад амінокислот, тоді як гістони дають нижчі показання. Для більшості застосувань похибка 5-10% є прийнятною і набагато краще, ніж завантаження зразків без будь-якої кількісної оцінки.

Що може заважати результатам аналізу BCA?

Відновники є найбільшою проблемою — DTT, β-меркаптоетанол і глутатіон всі відновлюють Cu²⁺ до Cu¹⁺ незалежно від білка, штучно завищуючи показання. Якщо ваш лізисний буфер містить відновники, розведіть зразки принаймні 1:10 для мінімізації впливу. Хелатуючі агенти (EDTA, EGTA) діють у протилежному напрямку, зв'язуючи іони міді, що зменшує розвиток кольору. Високі концентрації простих цукрів, ліпідів і амонійних сполук також можуть заважати. Технічний посібник Thermo Fisher з аналізу білка BCA містить вичерпну таблицю сумісності.

У чому різниця між аналізами BCA та Bradford?

Швидкість проти сумісності. Bradford дає результати за 5 хвилин, BCA вимагає 30 хвилин інкубації. Але Bradford руйнується в присутності детергентів — навіть 0,1% SDS зіпсує ваші показання. BCA витримує SDS, Triton X-100, NP-40 та інші детергенти, що зазвичай використовуються при лізисі клітин. Bradford також показує високу варіативність між білками, оскільки барвник Кумассі краще зв'язується з основними амінокислотами. BCA є більш послідовним для різних типів білків. Для клітинних лізатів BCA зазвичай кращий вибір. Для очищених білків у буферах без детергентів швидкість Bradford робить його привабливим.

Чому розрахований об'єм зразка занадто великий?

Великий розрахований об'єм означає, що концентрація білка нижча за очікувану. Поширені причини: недостатній лізис клітин (спробуйте додати більше детергенту або використати сонікацію), надмірне розведення зразків після лізису, деградація білка під час зберігання або помилки при піпетуванні під час налаштування аналізу BCA. Перевірте показання абсорбції — якщо воно нижче 0,1, ви близькі до межі виявлення, де невеликі похибки вимірювання перетворюються на великі похибки концентрації. Концентруйте зразок за допомогою центрифужних фільтрів (10-30 кДа MWCO підходить для більшості застосувань) або перейдіть до розширеного протоколу BCA для кращої чутливості з розведеними зразками.

Чи можу я використовувати цей калькулятор для інших методів кількісного визначення білка?

Розрахунок об'єму (маса зразка ÷ концентрація білка = об'єм зразка) застосовується універсально, але зв'язок між абсорбцією та концентрацією різниться між методами. Аналізи Bradford зазвичай використовують інші рівняння стандартної кривої, а УФ-абсорбція при 280 нм вимагає знання коефіцієнта екстинкції білка. Цей калькулятор оптимізований для аналізів BCA, де зв'язок абсорбції та концентрації має передбачувані закономірності. Для інших методів ви можете використовувати власні значення нахилу та перетину, якщо створили власну стандартну криву.

Як поводитися зі зразками з абсорбцією поза лінійним діапазоном?

Розведіть і виміряйте знову. Для показань вище 2,0 спробуйте розведення 1:5 або 1:10. Не намагайтеся розширити стандартну криву до вищих концентрацій, сподіваючись, що вона залишиться лінійною — це не так. Реакція відновлення міді насичується при високих концентраціях білка, causing the curve to flatten. Ви недооцінете концентрацію білка, якщо екстраполюєте за межі лінійного діапазону. Більшість стандартних кривих BCA залишаються лінійними приблизно від 20 до 2000 мкг/мл, хоча це varies with the specific protocol (standard, enhanced, or micro).

Який білок використовувати як стандарт?

BSA (бичачий сироватковий альбумін) є універсальним вибором — дешевий, стабільний, високорозчинний і доступний у високій чистоті. Кожен комплект BCA включає рекомендовані концентрації стандарту BSA. Підступність полягає в тому, що різні білки дають трохи різні відгуки через різний склад амінокислот. Якщо ви кількісно визначаєте білок, дуже відмінний від BSA (колаген, гістони, дуже основні або кислі білки), розгляньте можливість використання цього білка як стандарту, якщо він у вас очищений. Для рутинної роботи з клітинними лізатами BSA підходить чудово.

Скільки часу реакція BCA залишається стабільною?

Кілька годин при кімнатній температурі. Фіолетовий колір повністю розвивається через 30 хвилин при 37°C (стандартний протокол) або 2 години при кімнатній температурі, потім залишається стабільним принаймні 2-4 години. Це дає вам гнучкість у часі зчитування. Просто вимірюйте всі стандарти та зразки приблизно в той самий момент часу — не зчитуйте стандарти негайно, а зразки через 3 години.

Чи можна повторно використати стандартну криву з попереднього експерименту?

Не рекомендується. Хоча це може здатися економією часу, невеликі варіації температури інкубації, віку реактивів і калібрування спектрофотометра впливають на нахил і перетин стандартної кривої. Побудова свіжої стандартної кривої щоразу займає додаткові 15 хвилин, але забезпечує точну кількісну оцінку. Якщо ви проводите кілька аналізів BCA протягом одного дня, ви можете використовувати одну й ту саму стандартну криву для всіх вимірювань, зроблених з того самого планшета або в межах одного сеансу.

Посилання

  1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT та ін. "Вимірювання білка з використанням біцинхонінової кислоти." Аналітична біохімія. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7

  2. Thermo Scientific. "Набір для аналізу білка Pierce BCA." Інструкції. Доступно за адресою: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf

  3. Walker JM. "Аналіз біцинхонінової кислоти (BCA) для кількісного визначення білка." У: Walker JM, ред. Довідник протоколів білка. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3

  4. Olson BJ, Markwell J. "Аналізи для визначення концентрації білка." Поточні протоколи білкової науки. 2007;Розділ 3:Одиниця 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48

  5. Noble JE, Bailey MJ. "Кількісне визначення білка." Методи в enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

Оптимізуйте Процес Кількісного Визначення Білка

Аналізи BCA надають вам концентрації білка, але вам все ще потрібно перетворити ці числа на об'єми піпетування для ваших реальних експериментів. Цей калькулятор миттєво здійснює це перетворення, незалежно від того, готуєте ви один вестерн-блот чи розраховуєте об'єми для 96 зразків одночасно. Введіть показники поглинання, вкажіть цільові кількості білка та отримайте точні об'єми для послідовних експериментальних результатів.