Розрахуйте точні об'єми зразків на основі показників абсорбції BCA та бажаної маси білка. Необхідно для послідовного завантаження білка в західні блоти та інші лабораторні застосування.
Цей інструмент розраховує необхідний об'єм зразка на основі результатів абсорбції BCA та маси зразка. Введіть значення абсорбції та масу зразка для кожного зразка, щоб розрахувати відповідний об'єм зразка.
Об'єм зразка розраховується за наступною формулою:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Калькулятор об'єму зразка для вимірювання абсорбції BCA — це спеціалізований інструмент, розроблений для допомоги дослідникам та лабораторним технікам у точному визначенні відповідного об'єму зразка для експериментів на основі результатів аналізу BCA (біцинхонінової кислоти). Цей калькулятор використовує показники абсорбції з вашого аналізу BCA та бажану масу зразка для розрахунку точного об'єму, необхідного для послідовного навантаження білка в таких застосуваннях, як західний блотинг, ензиматичні аналізи та інші техніки аналізу білка.
Аналіз BCA є одним з найширше використовуваних методів для кількісного визначення білка в лабораторіях біохімії та молекулярної біології. Вимірюючи абсорбцію ваших білкових зразків та порівнюючи їх зі стандартною кривою, ви можете визначити концентрацію білка з високою точністю. Наш калькулятор спрощує цей процес, автоматично перетворюючи показники абсорбції в точні об'єми зразків, необхідні для ваших експериментів.
Аналіз біцинхонінової кислоти (BCA) — це біохімічний аналіз для визначення загальної концентрації білка в розчині. Принцип цього аналізу ґрунтується на утворенні комплексу Cu²⁺-білка в лужних умовах, за яким слідує відновлення Cu²⁺ до Cu¹⁺. Кількість відновлення пропорційна кількості білка, що присутній. BCA утворює пурпурний комплекс з Cu¹⁺ у лужному середовищі, що забезпечує основу для моніторингу відновлення міді білками.
Інтенсивність пурпурного кольору зростає пропорційно до концентрації білка, що може бути виміряно за допомогою спектрофотометра на приблизно 562 нм. Показники абсорбції потім порівнюються зі стандартною кривою для визначення концентрації білка в невідомих зразках.
Основна формула для розрахунку об'єму зразка на основі результатів абсорбції BCA:
Де:
Концентрація білка розраховується з показника абсорбції за допомогою рівняння стандартної кривої:
Для стандартного аналізу BCA типовий нахил приблизно дорівнює 2.0, а перетворення часто близьке до нуля, хоча ці значення можуть варіюватися в залежності від специфічних умов вашого аналізу та стандартної кривої.
Наш калькулятор спрощує процес визначення об'єму зразків за результатами аналізу BCA. Дотримуйтесь цих кроків, щоб отримати точні розрахунки:
Введіть інформацію про зразок:
Виберіть тип стандартної кривої:
Перегляньте результати:
Скопіюйте або експортуйте результати:
Давайте пройдемо через практичний приклад:
Це означає, що вам слід завантажити 13.33 μL вашого зразка, щоб отримати 20 μg білка.
Калькулятор надає кілька важливих відомостей:
Концентрація білка: Це розраховується з вашого показника абсорбції за допомогою вибраної стандартної кривої. Це представляє кількість білка на одиницю об'єму у вашому зразку (μg/μL).
Об'єм зразка: Це об'єм вашого зразка, що містить вашу бажану кількість білка. Це значення — те, що ви будете використовувати при підготовці ваших експериментів.
Попередження та рекомендації: Калькулятор може надавати попередження для:
Одним з найпоширеніших застосувань для цього калькулятора є підготовка зразків для західного блотингу. Послідовне навантаження білка є критично важливим для надійних результатів західного блоту, і цей калькулятор гарантує, що ви завантажуєте однакову кількість білка для кожного зразка, навіть коли їх концентрації відрізняються.
Приклад робочого процесу:
Для ензиматичних аналізів часто необхідно використовувати певну кількість білка для стандартизації умов реакції між різними зразками або експериментами.
Приклад робочого процесу:
У експериментах з імунопреципітацією важливо почати з послідовної кількості білка для порівняння результатів між різними умовами.
Приклад робочого процесу:
Під час очищення білка часто необхідно відстежувати концентрацію білка та розраховувати виходи на різних етапах.
Приклад робочого процесу:
Хоча калькулятор надає стандартні параметри для стандартних аналізів BCA, ви також можете ввести власні значення, якщо ви створили власну стандартну криву. Це особливо корисно, коли:
Щоб використовувати користувацьку стандартну криву:
Калькулятор дозволяє вам додавати кілька зразків і розраховувати їх обсяги одночасно. Це особливо корисно, коли ви готуєте зразки для експериментів, які вимагають послідовного навантаження білка між кількома умовами.
Переваги пакетної обробки:
Якщо ваш показник абсорбції перевищує 2.0, це може бути за межами лінійного діапазону аналізу BCA. У таких випадках:
Для показників абсорбції нижче 0.1 ви можете бути біля межі виявлення аналізу, що може вплинути на точність. Розгляньте:
Якщо калькулятор пропонує об'єм, який є занадто великим для вашого застосування:
Точне кількісне визначення білків є основною вимогою в біохімії та молекулярній біології з моменту виникнення цих галузей. Ранні методи спиралися на визначення вмісту азоту, що вимагало багато часу та спеціального обладнання.
Метод К'єльдаля (1883): Один з найперших методів для кількісного визначення білка, заснований на вимірюванні вмісту азоту.
Біуретний тест (початок 1900-х): Цей метод спирається на реакцію між пептидними зв'язками та іонами міді в лужному розчині, що призводить до утворення фіолетового кольору.
Аналіз Лоурі (1951): Розроблений Олівером Лоурі, цей метод поєднує біуретну реакцію з реагентом Фоліна-Ціокальтеу, підвищуючи чутливість.
Аналіз Бредфорда (1976): Маріон Бредфорд розробила цей метод, використовуючи барвник Coomassie Brilliant Blue G-250, який зв'язується з білками та зміщує максимум поглинання.
Аналіз BCA (1985): Розроблений Полом Смітом та колегами в компанії Pierce Chemical, цей метод поєднує біуретну реакцію з виявленням BCA, пропонуючи підвищену чутливість та сумісність з мийними засобами.
Аналіз BCA вперше був описаний у статті 1985 року Сміта та ін. під назвою "Вимірювання білка за допомогою біцинхонінової кислоти". Він був розроблений, щоб вирішити обмеження існуючих методів, зокрема перешкоди від різних хімічних речовин, які зазвичай використовуються в екстракції та очищенні білків.
Ключовою інновацією було використання біцинхонінової кислоти для виявлення іонів Cu¹⁺, що утворюються внаслідок відновлення Cu²⁺, утворюючи пурпурний комплекс, який можна виміряти спектрофотометром. Це надало кілька переваг:
З моменту свого впровадження аналіз BCA став одним з найширше використовуваних методів кількісного визначення білка в лабораторіях біохімії та молекулярної біології по всьому світу.
1=IF(B2<=0,"Помилка: Неправильна абсорбція",IF(C2<=0,"Помилка: Неправильна маса зразка",C2/(2*B2)))
2
3' Де:
4' B2 містить показник абсорбції
5' C2 містить бажану масу зразка в μg
6' Формула повертає необхідний об'єм зразка в μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Розрахувати концентрацію білка з абсорбції за допомогою стандартної кривої."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Абсорбція не може бути негативною")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Розрахувати необхідний об'єм зразка на основі абсорбції та бажаної маси."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Маса зразка повинна бути позитивною")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Обчислена концентрація білка повинна бути позитивною")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Приклад використання
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Для абсорбції {absorbance} і бажаної маси білка {sample_mass} μg:")
31 print(f"Концентрація білка: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Необхідний об'єм зразка: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Помилка: {e}")
351# Функція для розрахунку концентрації білка з абсорбції
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Абсорбція не може бути негативною")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Функція для розрахунку об'єму зразка
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Маса зразка повинна бути позитивною")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Обчислена концентрація білка повинна бути позитивною")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Приклад використання
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Для абсорбції %.2f і бажаної маси білка %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Концентрація білка: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Необхідний об'єм зразка: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Помилка: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Абсорбція не може бути негативною");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Маса зразка повинна бути позитивною");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Обчислена концентрація білка повинна бути позитивною");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Приклад використання
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Для абсорбції ${absorbance} і бажаної маси білка ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Концентрація білка: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Необхідний об'єм зразка: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Помилка: ${error.message}`);
37}
38Взаємозв'язок між абсорбцією та концентрацією білка зазвичай є лінійним у певному діапазоні. Нижче наведена візуалізація стандартної кривої BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Різні методи кількісного визначення білків мають різні переваги та обмеження. Ось як аналіз BCA порівнюється з іншими загальноприйнятими методами:
| Метод | Діапазон чутливості | Переваги | Обмеження | Найкраще підходить для |
|---|---|---|---|---|
| Аналіз BCA | 5-2000 μg/mL | • Сумісний з мийними засобами • Менша варіація між білками • Стабільний розвиток кольору | • Перешкоджають відновлювальні агенти • Підлягає впливу деяких хелатуючих агентів | • Загальне кількісне визначення білка • Зразки, що містять мийні засоби |
| Аналіз Бредфорда | 1-1500 μg/mL | • Швидкий (2-5 хв) • Невелика кількість перешкод | • Висока варіація між білками • Несумісний з мийними засобами | • Швидкі вимірювання • Зразки без мийних засобів |
| Метод Лоурі | 1-1500 μg/mL | • Добре відомий • Хороша чутливість | • Багато перешкод • Багато етапів | • Історична послідовність • Чисті білкові зразки |
| UV-абсорбція (280 нм) | 20-3000 μg/mL | • Неруйнівний • Дуже швидкий • Не потребує реагентів | • Вплив нуклеїнових кислот • Вимагає чистих зразків | • Чисті білкові розчини • Швидкі перевірки під час очищення |
| Флуорометричний | 0.1-500 μg/mL | • Найвища чутливість • Широкий динамічний діапазон | • Дорогі реагенти • Потребує флуориметра | • Дуже розведені зразки • Обмежений об'єм зразка |
Аналіз BCA (біцинхонінова кислота) в основному використовується для кількісного визначення загальної концентрації білка в зразку. Він широко використовується в біохімії, клітинній біології та молекулярній біології для таких застосувань, як західний блотинг, ензиматичні аналізи, імунопреципітація та очищення білка.
Аналіз BCA зазвичай точний в межах 5-10%, якщо його правильно виконати. Його точність залежить від кількох факторів, включаючи якість стандартної кривої, відсутність перешкод та чи подібний склад невідомого білка до стандартного білка, що використовується.
Декілька речовин можуть заважати результатам аналізу BCA, включаючи:
Основні відмінності полягають у тому, що:
Якщо ваш калькулятор показує дуже великий об'єм, це зазвичай вказує на низьку концентрацію білка у вашому зразку. Це може бути через:
Розгляньте можливість концентрації вашого зразка або коригування вашого експериментального дизайну, щоб врахувати нижчу концентрацію білка.
Цей калькулятор спеціально розроблений для результатів аналізу BCA. Хоча основний принцип (перетворення концентрації в об'єм) застосовується до інших методів, взаємозв'язок між абсорбцією та концентрацією білка варіюється між різними аналізами. Для інших методів, таких як Бредфорд або Лоурі, вам потрібно буде використовувати інші параметри стандартної кривої.
Для показників абсорбції за межами лінійного діапазону (зазвичай >2.0):
Сироватковий альбумін великої рогатої худоби (BSA) є найпоширенішим стандартом для аналізів BCA, оскільки він:
Проте, якщо ваші зразки містять переважаючий білок, який суттєво відрізняється від BSA, розгляньте можливість використання цього білка як вашого стандарту для більш точних результатів.
Пурпурний колір, що розвивається в реакції BCA, стабільний протягом кількох годин при кімнатній температурі і може бути виміряний у будь-який час протягом цього періоду. Проте для найкращих результатів рекомендується вимірювати всі стандарти та зразки приблизно в один і той же час після розвитку кольору.
Хоча технічно можливо повторно використовувати стандартну криву, це не рекомендується для точного кількісного визначення. Варіації в реагентах, умовах інкубації та калібруванні приладів можуть вплинути на взаємозв'язок між абсорбцією та концентрацією білка. Для надійних результатів генеруйте нову стандартну криву щоразу, коли ви виконуєте аналіз.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Вимірювання білка за допомогою біцинхонінової кислоти." Аналитическая биохимия. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Прилад для аналізу білка Pierce BCA." Інструкції. Доступно за: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "Аналіз біцинхонінової кислоти (BCA) для кількісного визначення білка." У: Walker JM, ред. Посібник з протоколів з білків. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Аналізи для визначення концентрації білка." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Кількісне визначення білка." Методи в ензимології. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Тепер, коли ви розумієте принципи, що стоять за кількісним визначенням білка BCA та розрахунком об'єму зразка, спробуйте наш калькулятор, щоб оптимізувати ваш лабораторний робочий процес. Просто введіть показники абсорбції та бажану масу зразка, щоб отримати миттєві, точні розрахунки об'єму зразка.
Чи ви готуєте зразки для західного блотингу, ензиматичних аналізів чи будь-якого іншого експерименту на основі білка, наш калькулятор допоможе забезпечити послідовні та надійні результати. Заощаджуйте час, зменшуйте помилки та покращуйте відтворюваність ваших експериментів за допомогою калькулятора об'єму зразка для вимірювання абсорбції BCA.
Відкрийте більше інструментів, які можуть бути корисними для вашого робочого процесу