Tính toán thể tích mẫu chính xác dựa trên các chỉ số độ hấp thụ của xét nghiệm BCA và khối lượng protein mong muốn. Cần thiết cho việc nạp protein đồng nhất trong các blot phương Tây và các ứng dụng phòng thí nghiệm khác.
Công cụ này tính toán thể tích mẫu cần thiết dựa trên kết quả hấp thụ BCA và khối lượng mẫu. Nhập giá trị hấp thụ và khối lượng mẫu cho mỗi mẫu để tính toán thể tích mẫu tương ứng.
Thể tích mẫu được tính toán bằng công thức sau:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Máy Tính Thể Tích Mẫu Độ Hấp Thụ BCA là một công cụ chuyên dụng được thiết kế để giúp các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên phòng thí nghiệm xác định chính xác thể tích mẫu phù hợp cho các thí nghiệm dựa trên kết quả thử nghiệm BCA (acid bicinchoninic). Máy tính này lấy các giá trị độ hấp thụ từ thử nghiệm BCA của bạn và khối lượng mẫu mong muốn của bạn để tính toán thể tích chính xác cần thiết cho việc tải protein đồng nhất trong các ứng dụng như blotting western, thử nghiệm enzym và các kỹ thuật phân tích protein khác.
Thử nghiệm BCA là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để định lượng protein trong các phòng thí nghiệm sinh hóa và sinh học phân tử. Bằng cách đo độ hấp thụ của các mẫu protein và so sánh chúng với đường chuẩn, bạn có thể xác định nồng độ protein với độ chính xác cao. Máy tính của chúng tôi giúp đơn giản hóa quá trình này bằng cách tự động chuyển đổi các giá trị độ hấp thụ thành thể tích mẫu chính xác cần thiết cho các thí nghiệm của bạn.
Thử nghiệm Acid Bicinchoninic (BCA) là một thử nghiệm sinh hóa để xác định nồng độ tổng thể của protein trong một dung dịch. Nguyên tắc của thử nghiệm này dựa trên việc hình thành một phức hợp Cu²⁺-protein dưới điều kiện kiềm, tiếp theo là sự khử Cu²⁺ thành Cu¹⁺. Lượng khử này tỷ lệ thuận với lượng protein có mặt. BCA hình thành một phức hợp màu tím với Cu¹⁺ trong môi trường kiềm, cung cấp một cơ sở để theo dõi sự khử đồng bởi các protein.
Cường độ của màu tím tăng tỷ lệ thuận với nồng độ protein, có thể được đo bằng cách sử dụng một máy quang phổ ở khoảng 562 nm. Các giá trị độ hấp thụ sau đó được so sánh với đường chuẩn để xác định nồng độ protein trong các mẫu chưa biết.
Công thức cơ bản để tính toán thể tích mẫu từ kết quả độ hấp thụ BCA là:
Trong đó:
Nồng độ protein được tính toán từ giá trị độ hấp thụ bằng cách sử dụng phương trình đường chuẩn:
Đối với một thử nghiệm BCA tiêu chuẩn, hệ số điển hình khoảng 2.0, và hằng số thường gần bằng không, mặc dù các giá trị này có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện thử nghiệm cụ thể của bạn và đường chuẩn.
Máy tính của chúng tôi giúp đơn giản hóa quá trình xác định thể tích mẫu từ kết quả thử nghiệm BCA. Làm theo các bước sau để có được các tính toán chính xác:
Nhập Thông Tin Mẫu:
Chọn Loại Đường Chuẩn:
Xem Kết Quả:
Sao Chép hoặc Xuất Kết Quả:
Hãy cùng đi qua một ví dụ thực tế:
Điều này có nghĩa là bạn nên tải 13.33 μL mẫu của bạn để có được 20 μg protein.
Máy tính cung cấp một số thông tin quan trọng:
Nồng Độ Protein: Đây là giá trị được tính toán từ độ hấp thụ của bạn bằng cách sử dụng đường chuẩn đã chọn. Nó đại diện cho lượng protein trên mỗi đơn vị thể tích trong mẫu của bạn (μg/μL).
Thể Tích Mẫu: Đây là thể tích của mẫu của bạn chứa lượng protein mong muốn. Giá trị này là những gì bạn sẽ sử dụng khi chuẩn bị cho các thí nghiệm của bạn.
Cảnh Báo và Khuyến Nghị: Máy tính có thể cung cấp cảnh báo cho:
Một trong những ứng dụng phổ biến nhất cho máy tính này là chuẩn bị mẫu cho blotting western. Việc tải protein đồng nhất là rất quan trọng để có được kết quả blotting western đáng tin cậy, và máy tính này đảm bảo bạn tải cùng một lượng protein cho mỗi mẫu, ngay cả khi nồng độ của chúng khác nhau.
Quy trình ví dụ:
Đối với các thử nghiệm enzym, thường cần sử dụng một lượng protein cụ thể để chuẩn hóa điều kiện phản ứng giữa các mẫu hoặc thí nghiệm khác nhau.
Quy trình ví dụ:
Trong các thí nghiệm lọc miễn dịch (IP), việc bắt đầu với một lượng protein đồng nhất là rất quan trọng để so sánh kết quả giữa các điều kiện khác nhau.
Quy trình ví dụ:
Trong quá trình lọc protein, thường cần theo dõi nồng độ protein và tính toán sản lượng ở các bước khác nhau.
Quy trình ví dụ:
Mặc dù máy tính cung cấp các tham số mặc định cho các thử nghiệm BCA tiêu chuẩn, bạn cũng có thể nhập các giá trị tùy chỉnh nếu bạn đã tạo đường chuẩn của riêng mình. Điều này đặc biệt hữu ích khi:
Để sử dụng đường chuẩn tùy chỉnh:
Máy tính cho phép bạn thêm nhiều mẫu và tính toán thể tích của chúng đồng thời. Điều này đặc biệt hữu ích khi chuẩn bị mẫu cho các thí nghiệm cần tải protein đồng nhất giữa nhiều điều kiện.
Lợi ích của việc xử lý hàng loạt:
Nếu giá trị độ hấp thụ của bạn vượt quá 2.0, nó có thể nằm ngoài phạm vi tuyến tính của thử nghiệm BCA. Trong những trường hợp như vậy:
Đối với các giá trị độ hấp thụ dưới 0.1, bạn có thể gần với ngưỡng phát hiện của thử nghiệm, điều này có thể ảnh hưởng đến độ chính xác. Cân nhắc:
Nếu máy tính gợi ý một thể tích quá lớn cho ứng dụng của bạn:
Việc định lượng chính xác protein đã là một yêu cầu cơ bản trong sinh hóa và sinh học phân tử kể từ khi các lĩnh vực này xuất hiện. Các phương pháp sớm dựa vào việc xác định hàm lượng nitơ, điều này tốn thời gian và yêu cầu thiết bị chuyên dụng.
Phương Pháp Kjeldahl (1883): Một trong những phương pháp đầu tiên để định lượng protein, dựa trên việc đo hàm lượng nitơ.
Thử Nghiệm Biuret (Đầu Thế Kỷ 20): Phương pháp này dựa vào phản ứng giữa các liên kết peptide và các ion đồng trong một dung dịch kiềm, tạo ra một màu tím.
Thử Nghiệm Lowry (1951): Được phát triển bởi Oliver Lowry, phương pháp này kết hợp phản ứng Biuret với thuốc thử Folin-Ciocalteu, tăng cường độ nhạy.
Thử Nghiệm Bradford (1976): Marion Bradford phát triển phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250, gắn vào các protein và chuyển đổi bước sóng hấp thụ.
Thử Nghiệm BCA (1985): Được phát triển bởi Paul Smith và các đồng nghiệp tại công ty hóa chất Pierce, phương pháp này kết hợp phản ứng biuret với phát hiện BCA, cung cấp độ nhạy cao hơn và khả năng tương thích với các chất tẩy rửa.
Thử nghiệm BCA lần đầu tiên được mô tả trong một bài báo năm 1985 của Smith et al. có tiêu đề "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Nó được phát triển để giải quyết các hạn chế của các phương pháp hiện có, đặc biệt là sự can thiệp từ các hóa chất khác nhau thường được sử dụng trong việc chiết xuất và tinh chế protein.
Đổi mới chính là việc sử dụng acid bicinchoninic để phát hiện các ion Cu¹⁺ được sản xuất bởi sự khử Cu²⁺ do protein, hình thành một phức hợp màu tím có thể được đo quang phổ. Điều này cung cấp một số lợi thế:
Kể từ khi được giới thiệu, thử nghiệm BCA đã trở thành một trong những phương pháp định lượng protein được sử dụng rộng rãi nhất trong các phòng thí nghiệm sinh hóa và sinh học phân tử trên toàn thế giới.
1=IF(B2<=0,"Lỗi: Độ hấp thụ không hợp lệ",IF(C2<=0,"Lỗi: Khối lượng mẫu không hợp lệ",C2/(2*B2)))
2
3' Trong đó:
4' B2 chứa giá trị độ hấp thụ
5' C2 chứa khối lượng mẫu mong muốn tính bằng μg
6' Công thức trả về thể tích mẫu cần thiết tính bằng μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Tính toán nồng độ protein từ độ hấp thụ bằng cách sử dụng đường chuẩn."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Độ hấp thụ không thể âm")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Tính toán thể tích mẫu cần thiết dựa trên độ hấp thụ và khối lượng mong muốn."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Khối lượng mẫu phải dương")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Nồng độ protein tính toán phải dương")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Ví dụ sử dụng
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Đối với độ hấp thụ {absorbance} và khối lượng protein mong muốn {sample_mass} μg:")
31 print(f"Nồng độ protein: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Thể tích mẫu cần thiết: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Lỗi: {e}")
351# Hàm để tính toán nồng độ protein từ độ hấp thụ
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Độ hấp thụ không thể âm")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Hàm để tính toán thể tích mẫu
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Khối lượng mẫu phải dương")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Nồng độ protein tính toán phải dương")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Ví dụ sử dụng
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Đối với độ hấp thụ %.2f và khối lượng protein mong muốn %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Nồng độ protein: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Thể tích mẫu cần thiết: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Lỗi: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Độ hấp thụ không thể âm");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Khối lượng mẫu phải dương");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Nồng độ protein tính toán phải dương");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Ví dụ sử dụng
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Đối với độ hấp thụ ${absorbance} và khối lượng protein mong muốn ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Nồng độ protein: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Thể tích mẫu cần thiết: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Lỗi: ${error.message}`);
37}
38Mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ protein thường là tuyến tính trong một phạm vi nhất định. Dưới đây là hình ảnh minh họa một đường chuẩn BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y1="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y1="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y1="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y1="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y1="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y1="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Các phương pháp định lượng protein khác nhau có những lợi thế và hạn chế khác nhau. Dưới đây là cách thử nghiệm BCA so sánh với các phương pháp phổ biến khác:
| Phương Pháp | Phạm Vi Độ Nhạy | Lợi Thế | Hạn Chế | Tốt Nhất Cho |
|---|---|---|---|---|
| Thử Nghiệm BCA | 5-2000 μg/mL | • Tương thích với các chất tẩy rửa • Ít biến động giữa các protein • Phát triển màu ổn định | • Bị ảnh hưởng bởi các tác nhân khử • Bị ảnh hưởng bởi một số chất tạo phức | • Định lượng protein tổng quát • Mẫu chứa chất tẩy rửa |
| Thử Nghiệm Bradford | 1-1500 μg/mL | • Nhanh (2-5 phút) • Ít chất can thiệp | • Biến động protein giữa các protein cao • Không tương thích với các chất tẩy rửa | • Đo lường nhanh • Mẫu không có chất tẩy rửa |
| Phương Pháp Lowry | 1-1500 μg/mL | • Được thiết lập tốt • Độ nhạy tốt | • Nhiều chất can thiệp • Nhiều bước | • Tính đồng nhất lịch sử • Mẫu protein tinh khiết |
| Độ Hấp Thụ UV (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Không phá hủy • Rất nhanh • Không cần hóa chất | • Bị ảnh hưởng bởi axit nucleic • Cần mẫu tinh khiết | • Dung dịch protein tinh khiết • Kiểm tra nhanh trong quá trình tinh chế |
| Phương Pháp Huỳnh Quang | 0.1-500 μg/mL | • Độ nhạy cao nhất • Phạm vi động rộng | • Hóa chất đắt tiền • Cần máy đo huỳnh quang | • Mẫu rất loãng • Thể tích mẫu hạn chế |
Thử nghiệm BCA (acid bicinchoninic) chủ yếu được sử dụng để định lượng nồng độ protein tổng thể trong một mẫu. Nó được sử dụng rộng rãi trong sinh hóa, sinh học tế bào, và sinh học phân tử cho các ứng dụng như blotting western, thử nghiệm enzym, lọc miễn dịch, và tinh chế protein.
Thử nghiệm BCA thường chính xác trong khoảng 5-10% khi được thực hiện đúng cách. Độ chính xác của nó phụ thuộc vào một số yếu tố bao gồm chất lượng của đường chuẩn, sự vắng mặt của các chất can thiệp, và liệu thành phần protein chưa biết có tương tự như protein tiêu chuẩn được sử dụng hay không.
Một số chất có thể can thiệp vào kết quả thử nghiệm BCA, bao gồm:
Các khác biệt chính là:
Nếu máy tính của bạn hiển thị một thể tích rất lớn, điều này thường chỉ ra rằng nồng độ protein trong mẫu của bạn thấp. Điều này có thể do:
Cân nhắc việc tập trung mẫu của bạn hoặc điều chỉnh thiết kế thí nghiệm của bạn để phù hợp với nồng độ protein thấp hơn.
Máy tính này được thiết kế đặc biệt cho các kết quả thử nghiệm BCA. Mặc dù nguyên tắc cơ bản (chuyển đổi nồng độ sang thể tích) áp dụng cho các phương pháp khác, mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ protein khác nhau giữa các thử nghiệm. Đối với các phương pháp khác như Bradford hoặc Lowry, bạn sẽ cần sử dụng các tham số đường chuẩn khác.
Đối với các giá trị độ hấp thụ nằm ngoài phạm vi tuyến tính (thường >2.0):
Huyết thanh bò albumin (BSA) là tiêu chuẩn thường được sử dụng nhất cho các thử nghiệm BCA vì nó:
Tuy nhiên, nếu các mẫu của bạn chứa một protein chiếm ưu thế khác biệt đáng kể so với BSA, hãy cân nhắc sử dụng protein đó làm tiêu chuẩn của bạn để có kết quả chính xác hơn.
Màu tím phát triển trong phản ứng BCA ổn định trong vài giờ ở nhiệt độ phòng và có thể được đo bất cứ lúc nào trong khoảng thời gian đó. Tuy nhiên, để có kết quả tốt nhất, nên đo tất cả các tiêu chuẩn và mẫu trong cùng một thời điểm sau khi phát triển màu.
Mặc dù về mặt kỹ thuật có thể tái sử dụng một đường chuẩn, nhưng không được khuyến nghị để có được định lượng chính xác. Sự thay đổi trong hóa chất, điều kiện ủ, và hiệu chuẩn thiết bị có thể ảnh hưởng đến mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ protein. Để có kết quả đáng tin cậy, hãy tạo một đường chuẩn mới mỗi khi bạn thực hiện thử nghiệm.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Hướng dẫn. Có sẵn tại: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Bây giờ bạn đã hiểu các nguyên tắc đằng sau việc định lượng protein BCA và tính toán thể tích mẫu, hãy thử máy tính của chúng tôi để đơn giản hóa quy trình làm việc trong phòng thí nghiệm của bạn. Chỉ cần nhập các giá trị độ hấp thụ của bạn và khối lượng mẫu mong muốn để nhận được các tính toán thể tích mẫu chính xác ngay lập tức.
Cho dù bạn đang chuẩn bị mẫu cho blotting western, thử nghiệm enzym, hay bất kỳ thí nghiệm nào khác dựa trên protein, máy tính của chúng tôi sẽ giúp đảm bảo kết quả đồng nhất và đáng tin cậy. Tiết kiệm thời gian, giảm lỗi, và cải thiện khả năng tái sản xuất của các thí nghiệm của bạn với Máy Tính Thể Tích Mẫu Độ Hấp Thụ BCA.
Khám phá thêm các công cụ có thể hữu ích cho quy trình làm việc của bạn