DNA连接计算器 - 分子克隆中的插入片段:载体比率计算

DNA连接是分子克隆中的一个步骤，在此过程中，插入片段通过T4 DNA连接酶与质粒载体连接。DNA连接计算器用于计算应混合多少微升的插入DNA和载体DNA，使反应达到设定的插入片段与载体摩尔比。

计算器的工作方式

该计算器需要输入六项数据：载体浓度、载体长度、插入片段浓度、插入片段长度、插入片段与载体的目标摩尔比，以及反应总体积。用户还可以设定所用载体DNA的量，默认值为50纳克（ng）。根据这些数值，计算器会计算应移取的载体体积、应移取的插入片段体积，以及为达到反应总体积还需加入的缓冲液或水的体积。

浓度以纳克/微升（ng/μL）表示，通常由Nanodrop或Qubit仪器测定。长度以碱基对（bp）表示。一千碱基（kb）等于1000个碱基对。摩尔比表示每一个载体分子应对应多少个插入片段分子，而不是质量比。

为什么使用摩尔比而不是质量比

相同质量的DNA不一定含有相同数量的分子。在分子数量相同的情况下，短插入片段的质量小于长载体。若将等量纳克数的短插入片段和长载体混合，相对于载体分子，插入片段分子的数量会少得多。计算器会按照片段长度之比调整插入片段的质量，使最终混合物中每个载体分子对应预期数量的插入片段分子。

DNA连接公式

所需插入片段 DNA 的量（以纳克计）为：

插入片段质量（ng）=载体质量（ng）×（插入片段长度（kb）÷载体长度（kb））×摩尔比

确定该质量后，计算器会将每种DNA的质量换算为可移液的体积：

载体体积（μL）=载体质量（ng）÷载体浓度（ng/μL）

插入片段体积（μL）=插入片段质量（ng）÷插入片段浓度（ng/μL）

缓冲液体积（μL）=反应总体积（μL）−载体体积（μL）−插入片段体积（μL）

如果载体和插入片段的体积之和大于反应总体积，就没有空间加入缓冲液、连接酶或水。在这种情况下，计算器会提示总体积过小，而不会显示负的缓冲液体积。

计算示例

研究人员正在将一个1 kb的基因片段克隆到一个3 kb的质粒载体中。计划在3:1的插入片段:载体摩尔比下，使用50 ng载体DNA，并将反应总体积设为20 μL。

输入：

• 载体浓度：50 ng/μL
• 载体长度：3000 bp（3 kb）
• 插入片段浓度：25 ng/μL
• 插入片段长度：1000 bp（1 kb）
• 摩尔比：3
• 总体积：20 μL
• 载体用量：50 ng

步骤1：插入片段用量

插入片段质量（ng）=50×（1÷3）×3=50 ng

步骤2：体积

载体体积=50 ng÷50 ng/μL=1 μL

插入片段体积=50 ng÷25 ng/μL=2 μL

缓冲液体积=20−1−2=17 μL

该反应包含1 μL载体、2 μL插入片段和17 μL缓冲液或水；连接酶及其反应缓冲液也加入其中。该混合物中每个载体分子对应三个插入片段分子。

连接反应的典型摩尔比

大多数带有黏性突出末端的标准克隆，在1:1 或 3:1 的插入片段:载体比例下效果良好，其中 3:1 是常用的起点。连接平末端的连接反应效率较低，因此常用更高的比例，例如 5:1。很大的插入片段有时用较低的比例效果更好，接近 1:1，因为大片段每个分子本身已经包含许多碱基对。

常见问题

什么是DNA连接？

DNA连接是将两个DNA片段，通常是质粒载体和插入片段，连接成一个连续分子的过程。T4 DNA连接酶封闭片段末端之间的连接处。

插入片段:载体摩尔比是什么意思？

它表示反应中每个载体分子对应的插入DNA分子数。3:1的比例表示每个载体分子对应三个插入片段分子，与它们的质量如何比较无关。

为什么不使用等量纳克数的载体和插入片段？

长度不同的DNA片段，其单分子质量也不同。逐分子比较，1 kb的插入片段质量约为3 kb载体的三分之一。若两者使用等量纳克数，分子数量不会相等，因此计算器会调整插入片段的质量，以达到目标摩尔比。

总体积过小意味着什么？

这意味着仅载体和插入片段的体积就已经占满整个反应体积，没有空间加入缓冲液或连接酶。解决方法是增加反应总体积，或使用浓度更高的DNA储液。

该计算器能否用于Gibson组装或Golden Gate克隆？

不能。这些方法使用不同的反应化学体系，通常以所有片段的等摩尔量为目标，而不是固定的插入片段:载体比例。它们的体积计算方式不同于标准T4 DNA连接酶克隆。

通常使用多少载体DNA？

50 ng是标准连接反应中常用的起始用量。实验室也会使用25至100 ng不等的用量，并根据DNA浓度和反应规模进行调整。

参考文献

1. 麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology）。7.13 Experimental Microbial Genetics, Fall 2008: Lab protocol (MIT OpenCourseWare)。MIT OCW 7.13 连接实验方案 — 插入片段的 ng 数 =（载体的 ng 数 × 插入片段的 kb 数 ÷ 载体的 kb 数）× 插入片段:载体摩尔比；每个反应使用 50 ng 载体。
2. 加州大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles），Iruela-Arispe 实验室。Vector:insert ratio protocol。UCLA 载体:插入片段比例实验方案 — 载体:插入片段的摩尔比为 1:1 或 1:3，在大多数情况下效果良好。