DNA退火温度计算器 | 免费PCR Tm工具

什么是 DNA 退火温度计算器？

DNA 退火温度计算器根据 DNA 引物的序列估算其熔解温度（Tm）。Tm 是一半引物分子与其目标链结合、另一半未结合时的温度。在聚合酶链式反应（PCR）中，该数值用于指导引物与 DNA 模板结合时所采用的温度。

为什么退火温度在 PCR 中很重要

PCR 通过反复进行加热和冷却循环来复制目标 DNA 片段。每个循环包含三个步骤。首先，在约 95 °C 的温度下加热，使双链模板分离。该步骤称为变性。其次，反应冷却至退火温度，通常介于 50 °C 和 65 °C 之间，使短引物能够与单链上的互补序列结合。第三，温度升高至约 72 °C，一种称为 DNA 聚合酶的酶延伸引物，构建新的 DNA 链。

如果退火温度过低，引物会与仅部分匹配的序列结合，从而产生额外的不需要的 DNA 片段。如果温度过高，引物无法与模板形成稳定结合，因此复制出的 DNA 很少或没有。PCR 反应失败时，退火温度通常是研究人员首先调整的参数之一。

GC 含量如何影响 Tm

引物通过氢键与其目标序列配对。鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）碱基对形成三个氢键。腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）碱基对形成两个氢键。含有更多 G 和 C 碱基的引物需要更多热量才能分离，因此其 Tm 高于长度相同但含有更多 A 和 T 碱基的引物。GC 含量通常以百分比表示：G 和 C 碱基的数量除以序列总长度，再乘以 100。

DNA 退火温度公式

本计算器根据引物长度选择两个公式中的一个。

对于长度为 14 个核苷酸或更长的引物，使用 Marmur-Doty GC 含量公式：

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

其中，N_GC 是引物中 G 和 C 碱基的数量，直接计数而不是以百分比表示。N 是碱基总数。

对于短于 14 个核苷酸的引物，使用 Wallace 规则：

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A、T、G 和 C 分别表示引物中相应碱基的数量。

两个公式都假定标准条件：引物 50 纳摩尔、Na+ 50 毫摩尔、pH 7.0，两者之间 14 个碱基的切换点也遵循同样的惯例。

算例

以 19 碱基的引物 ATGCTAGCTAGCTGCTAGC 为例。其长度为 19，达到或超过 14，因此计算器使用 Marmur-Doty 公式。

• 长度（N）= 19
• G 的数量 = 5，C 的数量 = 5，因此 N_GC = 10
• GC 含量 = 10 / 19 × 100 ≈ 52.6%
• Tm = 64.9 + 41 ×（10 − 16.4）/ 19
• Tm = 64.9 + 41 ×（−6.4）/ 19
• Tm = 64.9 − 13.8
• Tm ≈ 51.1 °C

该公式使用 GC 数量 10，而不是 GC 百分比 52.6。如果误用百分比，得到的 Tm 将接近 143 °C，这对于在 50 °C 至 95 °C 之间运行的 PCR 反应来说并不现实。

如何使用此计算器

仅使用字母 A、T、G 和 C 键入或粘贴引物序列。计算器会显示序列长度、以百分比表示的 GC 含量，以及计算得出的退火温度。结果可以复制到实验笔记或实验方案中。

选择 PCR 退火温度

Tm 是计算得到的估计值，并不能保证是实际可用的温度。许多 PCR 方案会先将实际退火步骤设定在计算 Tm 以下几度，然后根据凝胶上的结果进行调整。对于一对引物，通常以两条引物中较低的 Tm 值作为起始点。梯度 PCR 可同时在一系列温度下运行多个反应，是通过测试来确定最佳温度的常用方法。

估算 Tm 的其他方法

这里使用的 Marmur-Doty 公式和 Wallace 规则仅根据碱基组成进行快速近似计算。其他方法包括：

• 最近邻热力学考虑了每一对相邻碱基对稳定性的影响。一个广泛使用的引物工具的作者称它是针对 8 至 40 个碱基的寡核苷酸的首选方法。
• 盐浓度校正公式会根据反应缓冲液中 Na+ 或 K+ 离子的浓度加入校正项，因为较高的盐浓度会稳定 DNA 双链并提高 Tm。

对于同一条引物，不同计算器可能报告不同的 Tm 值，因为它们使用的公式不同。实际运行 PCR 并检查结果仍然是最终检验。

常见问题

什么是 DNA 退火温度？

它是 DNA 引物在 PCR 过程中与模板链上的互补序列结合时的温度。实验室通常会将该温度设定在引物计算所得的熔解温度（Tm）以下几度。

如何计算引物 Tm？

对于长度为 14 个碱基或更长的引物，Tm = 64.9 + 41 ×（GC 数量 − 16.4）/ 长度。对于短于 14 个碱基的引物，Tm = 2 ×（A+T 数量）+ 4 ×（G+C 数量）。

为什么 GC 含量会提高 Tm？

G-C 碱基对形成三个氢键，而 A-T 碱基对形成两个。G 和 C 碱基比例较高的引物需要更多能量，也就是更高的温度，才能与其目标序列分离。

PCR 退火温度应当等于计算所得的 Tm 吗？

不应当。大多数方案会先将温度设定在计算所得的 Tm 以下几度，然后再进行调整，因为 Tm 表示只有一半引物处于结合状态的温度。

引物长度会改变 Tm 吗？

会改变，但并非简单地随长度变化。长度位于 Marmur-Doty 公式的分母中，因此，GC 含量平均的较长引物，其 Tm 不一定高于较短但富含 GC 的引物。

为什么不同的 Tm 计算器会得出不同结果？

因为它们使用不同的公式。Wallace 规则、Marmur-Doty GC 含量公式、最近邻热力学模型和盐浓度校正公式，对于同一条引物可能分别给出不同的 Tm，有时相差数度。

参考文献

1. ROSALIND。What formula is used to calculate Melting Temperature (Tm)? ROSALIND 知识中心 — 对少于 14 个碱基的序列使用华莱士规则，对更长的序列使用 Tm = 64.9 + 41 × (G + C − 16.4) / N，并假定引物为 50 nM、Na+ 为 50 mM、pH 为 7.0。
2. SantaLucia J Jr。A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics。Proc Natl Acad Sci USA，1998。PMC19045 — 最近邻模型，将每一对相邻碱基的贡献相加。
3. Kibbe WA。OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator。Nucleic Acids Research，2007。PMC1933198 — 对 8 至 40 nt 的寡核苷酸，首选最近邻法；基本公式是最不推荐的。