蛋白质浓度计算器

蛋白质浓度计算器把分光光度计读出的吸光度换算成溶液中溶解的蛋白质量。结果通常以毫克每毫升（mg/mL）或微克每毫升（μg/mL）表示。计算基于比尔-朗伯定律，这是化学中把样品吸收多少光与其含有多少物质联系起来的关系式。

如何测量蛋白质浓度

大多数蛋白质在波长 280 纳米（nm）处强烈吸收紫外光。这种吸收主要来自蛋白质结构中的两种氨基酸，色氨酸和酪氨酸。分光光度计让光穿过样品，测量样品吸收了多少光。这一读数称为吸光度，在 280 纳米处测得时记为 A280。

在 280 纳米处测量吸光度速度快，而且不破坏样品。这使它有别于下文介绍的布拉德福德法或 BCA 法等化学方法。该方法最适合测量溶液中的纯化蛋白质，吸光度读数约在 0.1 到 1.0 之间。超出这一范围的读数可靠性较低，所以样品往往需要先稀释再测量。

蛋白质浓度公式

计算器把比尔-朗伯定律变形，以求解浓度：

C = (A × DF) / (ε × l)

C — 蛋白质浓度，单位为 mg/mL
A — 280 纳米处的吸光度（一个纯数，没有单位）
DF — 稀释倍数，即样品在测量前被稀释了多少倍
ε — 消光系数，是蛋白质特有的常数，单位为 L/(g·cm)
l — 光程，即光穿过样品的距离，单位为 cm（在标准比色皿中通常为 1 cm；比色皿是分光光度计中使用的小型玻璃或塑料容器）

要把结果换算成微克每毫升，将 mg/mL 的数值乘以 1,000。要求样品中蛋白质的总质量，将浓度乘以样品体积（单位为毫升）。

计算示例

某样品在 280 纳米处的吸光度读数为 0.5。样品未经稀释，所以稀释倍数为 1，并且是在标准的 1 cm 比色皿中测量的。该蛋白质是牛血清白蛋白（BSA），其消光系数为 0.667 L/(g·cm)。

C = (0.5 × 1) / (0.667 × 1) ≈ 0.75 mg/mL

在 1 mL 样品中，这相当于约 0.75 mg 的蛋白质总量，即 750 μg/mL。

常见蛋白质的消光系数

每种蛋白质吸收光的情况各不相同，因为各自含有的色氨酸和酪氨酸残基数目不同。消光系数描述的是特定蛋白质在 280 纳米处的这一性质，单位为 L/(g·cm)。常用的数值包括：

蛋白质	消光系数 ε（L/(g·cm)）
牛血清白蛋白（BSA）	0.667
免疫球蛋白 G（IgG）	1.38
溶菌酶	2.64
卵清蛋白	0.73

对于不在此列表中的蛋白质，计算器也可以接受自定义的消光系数。若蛋白质的氨基酸序列已知，可以把其中色氨酸、酪氨酸和胱氨酸残基的吸光度相加来估算这个值，这是吉尔（Gill）和冯·希佩尔（von Hippel）于 1989 年发表的方法。ProtParam 采用该方法，并使用佩斯（Pace）等人于 1995 年测得的系数：ε₂₈₀ =（色氨酸残基数 × 5,500）+（酪氨酸残基数 × 1,490）+（胱氨酸残基数 × 125）。该公式给出的结果单位为 M⁻¹cm⁻¹，是摩尔单位，与上文以质量为基础的 L/(g·cm) 数值不同。由 ExPASy 服务器托管的 ProtParam 等免费工具，可以直接根据蛋白质序列计算这个值。

光程与稀释倍数

光程是盛放样品的比色皿的宽度，以厘米计。标准比色皿宽 1 cm。测量极小样品体积的微量分光光度计，光程可能短得多，例如 0.1 cm。

稀释倍数用来反映测量前进行的任何稀释。如果浓缩样品的吸光度会高于 1.0，通常先用缓冲液稀释。稀释倍数等于稀释后的总体积除以原样品体积。例如，将 10 μL 样品与 990 μL 缓冲液混合，总体积为 1,000 μL，稀释倍数为 100。

测量蛋白质浓度的其他方法

在 280 纳米处测吸光度是实验室中几种常用方法之一。

布拉德福德法：使用一种与蛋白质结合后会变色的染料。它适用于未纯化的样品，但不同蛋白质之间的颜色变化可能有差异。
BCA 法：依赖蛋白质肽键引起的颜色变化。它与多种去垢剂兼容，但比直接测吸光度耗时更长。
劳里法：一种较早的方法，灵敏度很高，但与一些常见的缓冲液成分反应不佳。

这三种方法都会破坏样品。直接测 A280 则不会，因此同一份样品可以回收并再次使用。

常见问题

这种方法的理想吸光度范围是多少？

在 0.1 与 1.0 之间。低于 0.1 时，读数不精确。高于 1.0 时，吸光度与浓度之间可能不再呈直线关系，所以应先稀释样品。

为什么在 280 纳米而不是 260 纳米处测量？

DNA 和 RNA 等核酸在 260 纳米处吸收很强。蛋白质因含有色氨酸和酪氨酸，在 280 纳米处吸收更多。在 280 纳米处测量，可以减少样品中可能存在的核酸造成的干扰。

对于未列出的蛋白质，如何得到消光系数？

对于序列已知的蛋白质，可以用 ProtParam 之类的工具，根据色氨酸、酪氨酸和胱氨酸残基的数目计算。也可以直接测量，方法是把样品的吸光度与已知浓度的溶液比较。

这种方法适用于蛋白质混合物吗？

它最适合已知消光系数的单一纯化蛋白质。对于未知蛋白质的混合物，例如细胞裂解液，通常改用布拉德福德法或 BCA 法测量，因为这些方法对总蛋白量给出的估计更一致。

去垢剂会干扰读数吗？

会干扰。许多去垢剂在 280 纳米附近吸收光，可能使结果失真。使用含有相同去垢剂浓度的空白样品，有助于抵消这部分背景吸光度。去垢剂浓度很高时，可能需要改用兼容去垢剂的检测方法，例如 BCA 法。

参考文献

瑞士生物信息学研究所（SIB），ExPASy。ProtParam documentation。ProtParam 文档 — 水中 280 纳米处的消光系数，由 Ext(Tyr) = 1490、Ext(Trp) = 5500 和 Ext(Cystine) = 125 得出；方法来自吉尔和冯·希佩尔（1989），系数来自佩斯等人（1995）。

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