蛋白质浓度计算器 | A280 转换为 mg/mL

蛋白质浓度计算器

蛋白质浓度计算器可将分光光度计测得的光吸收读数转换为溶液中溶解蛋白质的含量。结果通常以毫克/毫升（mg/mL）或微克/毫升（μg/mL）表示。计算基于比尔-朗伯定律，这是一种化学关系，用于描述样品吸收的光量与其中所含物质数量之间的联系。

如何测量蛋白质浓度

大多数蛋白质会在 280 纳米（nm）波长处强烈吸收紫外光。这种吸收主要来自蛋白质结构中的两种氨基酸：色氨酸和酪氨酸。分光光度计使光线穿过样品，并测量样品吸收了多少光。这一读数称为吸光度；当测量波长为 280 nm 时，称为 A280。

在 280 nm 处测量吸光度速度快，且不会破坏样品。这一点使其区别于下文介绍的 Bradford 或 BCA 等化学方法。该方法最适用于溶液中的纯化蛋白质，吸光度读数应在约 0.1 到 1.0 之间。超出这一范围的读数可靠性较低，因此通常需要在测量前对样品进行稀释。

蛋白质浓度计算公式

计算器对比尔-朗伯定律进行变形，以求得浓度：

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — 蛋白质浓度，单位为 mg/mL
• A — 280 nm 处的吸光度（无单位的纯数值）
• DF — 稀释因子，即原始样品在测量前被稀释的倍数
• ε — 消光系数，与特定蛋白质对应的常数，单位为 L/(g·cm)
• l — 光程，即光线穿过样品的距离，单位为 cm（标准比色皿通常为 1 cm；比色皿是分光光度计中使用的小型玻璃或塑料容器）

要将结果转换为微克/毫升，可将 mg/mL 数值乘以 1,000。要计算样品中的蛋白质总质量，可将浓度乘以样品体积（以毫升为单位）。

计算示例

某样品在 280 nm 处的吸光度读数为 0.5。该样品未经稀释，因此稀释因子为 1，并且使用标准 1 cm 比色皿进行测量。蛋白质为牛血清白蛋白（BSA），其消光系数为 0.667 L/(g·cm)。

C = (0.5 × 1) / (0.667 × 1) ≈ 0.75 mg/mL

在 1 mL 样品中，这相当于约 0.75 mg 蛋白质总量，或 750 μg/mL。

常见蛋白质的消光系数

每种蛋白质吸收光的方式不同，因为它们含有的色氨酸和酪氨酸残基数量不同。消光系数用于描述特定蛋白质在 280 nm 处的这一特性，单位为 L/(g·cm)。常用数值包括：

对于不在此列表中的蛋白质，计算器也可以接受自定义消光系数。对于已知氨基酸序列的蛋白质，可以使用 Gill 和 von Hippel 于 1989 年发表的公式估算该数值：ε₂₈₀ = (色氨酸残基数 × 5,500) + (酪氨酸残基数 × 1,490) + (胱氨酸残基数 × 125)。该公式给出的结果单位为 M⁻¹cm⁻¹，是摩尔单位，与上文基于质量的 L/(g·cm) 数值不同。由 ExPASy 服务器提供的 ProtParam 等免费工具，可以直接根据蛋白质序列计算该数值。

光程和稀释因子

光程是盛放样品的比色皿宽度，以厘米为单位测量。标准比色皿的宽度为 1 cm。用于测量极少量样品的微量分光光度计可能采用更短的光程，例如 0.1 cm。

稀释因子用于表示测量前进行的任何稀释。如果浓缩样品的吸光度会高于 1.0，通常会先用缓冲液对其进行稀释。稀释因子等于稀释后的总体积除以原始样品体积。例如，将 10 μL 样品与 990 μL 缓冲液混合后，总体积为 1,000 μL，稀释因子为 100。

测量蛋白质浓度的其他方法

280 nm 处的吸光度是实验室中使用的几种常见方法之一。

• Bradford 法：使用一种与蛋白质结合后会变色的染料。该方法适用于未纯化样品，但不同蛋白质引起的颜色变化可能不同。
• BCA 法：依靠蛋白质肽键引起的颜色变化。该方法与许多去污剂兼容，但运行时间比直接测量吸光度更长。
• Lowry 法：一种较早的方法，灵敏度很高，但会与某些常见缓冲液成分发生较差的反应。

以上三种方法都会破坏样品。直接进行 A280 测量则不会，因此可以回收同一样品并再次使用。

常见问题

这种方法的理想吸光度范围是多少？

在 0.1 到 1.0 之间。低于 0.1 时，读数不够精确。高于 1.0 时，吸光度与浓度之间的关系可能不再是直线，因此应先对样品进行稀释。

为什么在 280 nm 而不是 260 nm 处测量？

DNA 和 RNA 等核酸会在 260 nm 处强烈吸收光。由于蛋白质含有色氨酸和酪氨酸，它们在 280 nm 处的吸收更强。在 280 nm 处测量可以减少样品中核酸对结果的干扰。

如何确定列表中没有的蛋白质的消光系数？

对于已知序列的蛋白质，可以使用 ProtParam 等工具，根据色氨酸、酪氨酸和胱氨酸残基的数量计算消光系数。也可以通过直接测量得到：将样品的吸光度与已知浓度溶液的吸光度进行比较。

这种方法适用于蛋白质混合物吗？

该方法最适用于具有已知消光系数的单一纯化蛋白质。对于细胞裂解液等含有未知蛋白质的混合物，通常使用 Bradford 法或 BCA 法进行测量，因为这些方法对蛋白质总量的估算更加一致。

去污剂会干扰读数吗？

会。许多去污剂会吸收接近 280 nm 的光，从而使结果出现偏差。使用含有相同浓度去污剂的空白样品，有助于抵消这部分背景吸光度。去污剂浓度非常高时，可能需要改用 BCA 等兼容去污剂的检测方法。