Калкулатор за разреждане на клетки - Точен инструмент за лабораторно разреждане

Калкулатор за разреждане на клетъчни суспензии

Калкулаторът за разреждане на клетки определя какво количество клетъчна суспензия и разредител трябва да се смесят, за да се достигне зададена концентрация на клетките в избран краен обем. Използва се в клетъчни култури, микробиологията и други лабораторни дейности, при които пробата трябва да бъде доведена до точна концентрация преди употреба.

Какво означава разреждане на клетки

Разреждането на клетъчна суспензия не променя броя на клетките в нея. То променя само обема на течността, в която се намират клетките, и така понижава концентрацията. Суспензия, преброена при 1 000 000 клетки на милилитър (клетки/мл), все още съдържа същия общ брой клетки след разреждането. Този брой просто е разпределен в по-голямо количество течност.

В лабораториите клетките се разреждат преди много рутинни процедури: разделяне на растяща култура в нови колби, засяване на фиксиран брой клетки във всяка ямка на плака, замразяване на клетки за съхранение или подготовка на проба за клетъчен брояч или проточен цитометър.

Формула за разреждане на клетки

Изчислението се основава на едно правило. Броят на клетките, взети от изходната суспензия, умножен по нейната концентрация, трябва да е равен на броя на клетките в крайния обем, умножен по зададената концентрация:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — начална (изходна) концентрация, в клетки/мл
• V₁ — обем на изходната суспензия, който трябва да се използва, в мл
• C₂ — зададена концентрация, в клетки/мл
• V₂ — необходим общ краен обем, в мл

Решаването на уравнението за V₁ дава обема на изходната суспензия, който трябва да се пипетира:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Останалата част от крайния обем е разредител, обикновено хранителна среда за клетъчни култури, фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS) или друг буфер:

Обем на разредителя = V₂ − V₁

Зададената концентрация (C₂) никога не може да е по-висока от изходната концентрация (C₁). Разреждането само понижава концентрацията. За повишаването ѝ клетките трябва да се центрофугират и ресуспендират в по-малко количество течност.

Как се изчислява разреждане на клетки

1. Пребройте клетките в изходната суспензия с хемоцитометър или автоматичен клетъчен брояч, за да получите C₁.
2. Запишете зададената концентрация, C₂, изисквана от протокола.
3. Определете необходимия общ краен обем, V₂.
4. Изчислете V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Изчислете обема на разредителя като V₂ − V₁.
6. Пипетирайте V₁ от изходната суспензия в епруветка, след което добавете съответния обем хранителна среда или буфер като разредител.

Пример с решение

Изходна суспензия е преброена при 1 000 000 клетки/мл. Протоколът изисква 100 000 клетки/мл в краен обем от 10 ml.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 ml

Обем на разредителя = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 ml

Вземането на 1 ml от изходната суспензия и добавянето на 9 ml хранителна среда дава 10 ml суспензия с концентрация 100 000 клетки/мл.

Втори пример

Анализ с плака с 96 ямки изисква 10 000 клетки на ямка в 200 микролитра (μL) среда на ямка. Това е зададена концентрация от 50 000 клетки/мл, тъй като 10 000 клетки, разделени на 0,2 ml, дават 50 000 клетки/мл. Изходната суспензия е преброена при 2 000 000 клетки/мл, а са необходими общо 20 ml, за да се покрие плаката с известно количество в резерв за загуби при пипетиране.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 ml

Обем на разредителя = 20 − 0,5 = 19,5 ml

Смесването на 0,5 ml от изходната суспензия с 19,5 ml среда дава 20 ml с концентрация 50 000 клетки/мл, тоест разреждане 1 към 40.

Източници на грешки

Самата формула е точна. Грешките произтичат от въведените в нея числа.

• Грешка при броенето. Неправилното преброяване на клетките директно води до неправилно разреждане. Преброяването на четирите ъглови квадрата на мрежата на хемоцитометъра и усредняването на резултатите намалява този риск.
• Агрегирани клетки. Под микроскоп агрегатът от клетки изглежда като една клетка, но всъщност се състои от няколко, така че понижава привидната концентрация.
• Диапазон на пипетата. Пипета, използвана извън номиналния си обемен диапазон, дава неточни резултати. Пипета с обхват 1000 мкл, настроена да дозира 5 мкл, не е надеждна; вместо нея трябва да се използва по-малка пипета.
• Объркване на единиците. Смесването на клетки/мл с клетки/μл води до грешка, хиляда пъти по-голяма или по-малка от правилната стойност.
• Мъртви клетки. При обикновено преброяване се включват и мъртвите клетки, освен ако не е използвано оцветяване за жизнеспособност, например с трипаново синьо. Това може да завиши броя на действително наличните живи клетки.

Ограничения на този калкулатор

Калкулаторът отхвърля числа, за които не може да даде полезен резултат:

• Всяка стойност трябва да е по-голяма от нула.
• Зададената концентрация не може да е по-висока от началната концентрация.
• Началната концентрация трябва да е най-много 1 трилион клетки/мл (1 × 10¹²).
• Изчисленият обем на изходната суспензия трябва да е най-малко 0,001 ml, което е 1 микролитър. По-малък обем не може да се пипетира точно, затова калкулаторът изисква други числа. Обикновено това се поправя чрез увеличаване на общия обем.

Обемите се показват с два знака след десетичната запетая или с три, когато обемът на изходната суспензия е под 0,01 ml, така че малък обем никога да не се показва като 0,00 ml.

Често задавани въпроси

Каква е формулата за разреждане на клетки?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, където C₁ и C₂ са началната и зададената концентрация, а V₁ и V₂ са взетият от изходната суспензия обем и общият краен обем.

Може ли зададената концентрация да е по-висока от началната концентрация?

Не. Разреждането само понижава концентрацията. За достигане на по-висока концентрация клетките трябва да се центрофугират и ресуспендират в по-малък обем.

Каква течност трябва да се използва за разреждане на клетки?

Пълна хранителна среда за клетъчни култури се използва, когато клетките трябва да останат жизнеспособни в продължение на часове или дни, например преди засяване на плака. PBS или подобен буфериран физиологичен разтвор е подходящ за кратки разреждания, с продължителност под около 30 минути, преди по-нататъшна обработка на клетките. Среда без серум се използва, когато серумните протеини биха повлияли на последващ анализ.

Работи ли тази формула за бактерии или дрожди?

Да. C₁V₁ = C₂V₂ се прилага за всяка суспензия от частици, включително бактерии, измерени в колониеобразуващи единици на милилитър (CFU/мл), дрожди и вирусни частици, измерени в плакообразуващи единици на милилитър (PFU/мл), ако от двете страни на уравнението се използват едни и същи единици.

Трябва ли мъртвите клетки да се включват при разреждането?

При засяване на жива култура трябва да се броят само жизнеспособните клетки. Ако една суспензия е с жизнеспособност 80%, жизнеспособната ѝ концентрация е 0,8 пъти общият брой клетки и именно тази концентрация трябва да се използва като C₁.

Как могат да се приготвят точно много големи разреждания?

Големите разреждания, например 1 към 1000, обикновено се правят като поредица от по-малки стъпки, наречени серийни разреждания. Три последователни разреждания 1 към 10 достигат общо разреждане 1 към 1000, като всяка стъпка на пипетиране остава в точния обемен диапазон.