Calculadora d'Activitat Enzimàtica - Cinètica de Michaelis-Menten

Calculadora de l’activitat enzimàtica

Una calculadora de l’activitat enzimàtica determina amb quina rapidesa un enzim converteix el substrat en producte, expressada com a activitat específica en unitats per mil·ligram (U/mg). Utilitza l’equació de Michaelis-Menten, el model estàndard de la cinètica enzimàtica, juntament amb la quantitat de proteïna enzimàtica de la mostra.

Els enzims són proteïnes que acceleren les reaccions químiques a les cèl·lules sense consumir-se. Els científics mesuren l’activitat d’un enzim per comparar diferents lots, comprovar si una etapa de purificació ha funcionat o analitzar com un fàrmac afecta la velocitat de l’enzim. La concentració enzimàtica per si sola no indica si l’enzim està fent la seva funció. L’activitat específica sí que ho indica.

Què calcula la calculadora

L’eina rep cinc dades: la concentració de l’enzim, la concentració del substrat, la constant de Michaelis (Km), la velocitat màxima (Vmax) i el temps de reacció. El temps de reacció es registra com a referència, però no entra a la fórmula. Vmax ja és una velocitat, és a dir, una quantitat de substrat convertida per minut, de manera que el temps ja hi està incorporat. Dividir-hi de nou comptaria el temps dues vegades.

La calculadora retorna un número i un gràfic:

• Activitat específica, en U/mg. És la velocitat de reacció dividida per la quantitat de proteïna enzimàtica present.
• Un gràfic de la velocitat de reacció en funció de la concentració del substrat, que mostra les parts baixa, de transició i de saturació de la corba. Hi queda marcada la velocitat corresponent a la concentració de substrat introduïda.

Com calcular l’activitat enzimàtica

L’equació de Michaelis-Menten

Leonor Michaelis i Maud Menten van publicar aquest model l’any 1913. Descriu com depèn la velocitat de reacció d’un enzim de la concentració del substrat:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = velocitat de reacció, la velocitat a una concentració determinada de substrat
• $V_{max}$ = velocitat màxima, la velocitat quan l’enzim està completament saturat de substrat
• $[S]$ = concentració del substrat
• $K_m$ = constant de Michaelis: la concentració del substrat a la qual la velocitat és la meitat de Vmax

Fórmula de l’activitat específica

L’activitat específica divideix aquesta velocitat per la quantitat de proteïna enzimàtica present i dona un resultat en unitats per mil·ligram (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Aquí, $A$ és l’activitat específica i $[E]$ és la concentració de l’enzim.

Una unitat enzimàtica (U) és la quantitat d’enzim que converteix 1 micromol (µmol) de substrat per minut. La Unió Internacional de Bioquímica i Biologia Molecular (IUBMB) va establir aquesta definició.

Les unitats es combinen de la manera següent. A l’equació de Michaelis-Menten, la velocitat té les unitats de concentració del substrat dividida pel temps. La calculadora utilitza [S] i Km en mM, de manera que Vmax i v s’expressen en µmol per minut i per mil·lilitre, escrit µmol/(min·mL). Això és equivalent a mM/min i també a U/mL. La concentració de l’enzim [E] s’expressa en mg/mL. En dividir, els mil·lilitres es cancel·len:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax ja inclou «per minut», de manera que no cal cap terme de temps separat a la fórmula.

Aquest càlcul assumeix que la velocitat mesurada és una velocitat inicial, obtinguda al principi de la reacció, abans que el substrat disminueixi massa o que el producte comenci a inhibir l’enzim. Els laboratoris solen mesurar el primer 5–10% de conversió del substrat per mantenir-se en aquest interval lineal.

Exemple resolt

Exemple 1. Concentració de l’enzim 1 mg/mL, concentració del substrat 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Aquests són els valors inicials de la calculadora.

Velocitat = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Activitat específica = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Exemple 2. Les mateixes condicions, però amb la concentració de l’enzim duplicada fins a 2 mg/mL.

Velocitat = 33,33 µmol/(min·mL), sense canvis, ja que la velocitat no depèn de [E] en aquesta equació. Activitat específica = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Duplicar la quantitat d’enzim redueix a la meitat l’activitat específica, perquè ara la mateixa velocitat total es divideix entre el doble de proteïna.

Exemple 3. El substrat augmenta fins a 100 mM, molt per sobre de Km, amb una concentració de l’enzim de 1 mg/mL, Km 5 mM i Vmax 50 µmol/(min·mL).

Velocitat = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Activitat específica = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

A una concentració elevada de substrat, l’enzim està gairebé saturat, de manera que la velocitat s’acosta a Vmax.

Exemple 4. El substrat disminueix fins a 1 mM, per sota de Km, amb una concentració de l’enzim de 1 mg/mL, Km 5 mM i Vmax 50 µmol/(min·mL).

Velocitat = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Activitat específica = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Per sota de Km, les petites quantitats de substrat limiten la reacció, de manera que tant la velocitat com l’activitat específica queden molt per sota de Vmax.

Explicació dels paràmetres principals

La concentració de l’enzim [E] és la massa de proteïna enzimàtica per volum, expressada en mg/mL. Un valor més alt distribueix la mateixa velocitat de reacció entre més proteïna i redueix l’activitat específica. L’activitat específica, i no la concentració sense més, mostra si una preparació enzimàtica funciona bé.

La concentració del substrat [S] és la quantitat de substrat disponible per a l’enzim, normalment expressada en mM. A valors baixos de [S], petits augments provoquen un fort increment de la velocitat. Prop de la saturació, afegir més substrat gairebé no ajuda.

La constant de Michaelis (Km) és la concentració del substrat a la qual la velocitat equival a la meitat de Vmax. Un Km baix significa que l’enzim arriba a la meitat de la velocitat màxima amb una concentració baixa de substrat, cosa que indica una unió forta entre l’enzim i el substrat. Per exemple, l’hexocinasa té un Km proper a 0,1 mM per a la glucosa, fet que mostra una afinitat elevada.

La velocitat màxima (Vmax) és la velocitat quan el substrat ja no és limitant. Introduïu-la en µmol/(min·mL), equivalent a mM/min o U/mL, perquè coincideixi amb els mM utilitzats per a [S] i Km. Depèn de la quantitat d’enzim present i de la rapidesa amb què cada molècula d’enzim pot transformar el substrat (el seu nombre de recanvi, kcat).

El temps de reacció és la durada de l’assaig. Ajuda a planificar un experiment, perquè una reacció que es manté massa temps pot esgotar el substrat i deixar de comportar-se linealment. No forma part de la fórmula de l’activitat específica.

Lectura de la corba de velocitat

El gràfic representa la velocitat en funció de la concentració del substrat mitjançant l’equació de Michaelis-Menten.

• Per sota de Km: la velocitat augmenta aproximadament en proporció al substrat. Petits errors en la concentració del substrat provoquen grans errors en el resultat.
• Prop de Km: la corba es corba. La velocitat és la meitat de Vmax.
• Per sobre de Km: la corba s’aplana. Afegir més substrat aporta poc augment de la velocitat, perquè l’enzim està gairebé saturat.

Per què és important l’activitat específica

L’activitat específica és una mesura estàndard de la puresa i la qualitat d’un enzim. Durant la purificació, els científics la controlen en cada etapa: un extracte cel·lular cru pot mostrar uns quants U/mg, mentre que una mostra molt purificada pot arribar a centenars o milers d’U/mg. Un augment de l’activitat específica al llarg del procés de purificació mostra que s’està eliminant la proteïna inactiva mentre es conserva l’enzim d’interès.

La mateixa mesura s’utilitza en el descobriment de fàrmacs, on els investigadors comproven com els compostos candidats redueixen l’activitat d’un enzim, i en el diagnòstic clínic, on els metges mesuren enzims com l’ALT i l’AST a la sang per detectar lesions hepàtiques.

Preguntes més freqüents

Com es calcula l’activitat enzimàtica a partir de Km i Vmax? Primer cal trobar la velocitat de reacció amb l’equació de Michaelis-Menten, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Després, cal dividir-la per la concentració de l’enzim per obtenir l’activitat específica en U/mg: Activitat = v / [E]. Manteniu Vmax en µmol/(min·mL) i [E] en mg/mL perquè les unitats es cancel·lin i donin U/mg.

Què és una unitat (U) d’activitat enzimàtica? Una unitat és la quantitat d’enzim que converteix 1 µmol de substrat per minut en les condicions indicades, segons la definició de la IUBMB.

Per què la fórmula no inclou el temps de reacció? Vmax ja s’expressa com una quantitat per minut, de manera que és una velocitat, no una quantitat total. Tornar a dividir pel temps el comptaria dues vegades i faria que el resultat depengués de la durada de l’assaig, cosa que no hauria de passar amb una propietat del mateix enzim.

Per què l’activitat específica disminueix quan augmenta la concentració de l’enzim? La velocitat de l’equació de Michaelis-Menten no depèn de la concentració de l’enzim. L’activitat específica divideix aquesta velocitat fixa per [E], de manera que un valor més gran de [E] dona un resultat més petit. La comparació de l’activitat específica, i no de la velocitat sense més, permet comparar de manera justa preparacions enzimàtiques amb concentracions diferents.

Què significa un Km baix? Un Km baix significa que l’enzim arriba a la meitat de la seva velocitat màxima amb una concentració baixa de substrat, cosa que indica que l’enzim i el substrat s’uneixen fortament.

L’activitat específica pot ser negativa? No. Un resultat negatiu indica un error en les dades d’entrada, com ara una concentració negativa, o un error de càlcul, no una mesura enzimàtica real.

Referències

1. Michaelis, L., i Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., i Stryer, L. (2012). Biochemistry (7a ed.). W.H. Freeman and Company.
3. Unió Internacional de Bioquímica i Biologia Molecular (IUBMB). Nomenclatura enzimàtica. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. Base de dades d’enzims BRENDA. https://www.brenda-enzymes.org/