Calculadora de Solubilitat de Proteïnes - Eina Gratuïta de pH i Temperatura

Una calculadora de solubilitat proteica estima la concentració màxima d’una proteïna que es manté dissolta en un dissolvent a un pH, una temperatura i una força iònica determinats. Converteix la química bàsica en un sol nombre, en mil·ligrams de proteïna per mil·lilitre de dissolvent.

La solubilitat de les proteïnes és important en bioquímica, formulació de medicaments i ciència dels aliments. Una proteïna que no es manté dissolta forma agregats o precipitats, cosa que pot arruïnar un experiment o fer que un medicament no es pugui injectar.

Com calcular la solubilitat d’una proteïna

La solubilitat depèn de cinc factors: el punt isoelèctric de la proteïna (el pH al qual la seva càrrega neta és zero), el punt de fusió (la temperatura a la qual comença a desplegar-se), la constant dielèctrica del dissolvent (una mesura de la seva capacitat per separar partícules carregades), el pH de la solució i la força iònica (una mesura de la quantitat de sal dissolta).

La calculadora parteix de la solubilitat coneguda de cada proteïna en aigua en unes condicions de referència: 25 °C, pH 7,0 i una força iònica de 0,15 M (aproximadament el nivell de sal de la sang). Després multiplica aquest valor de referència per quatre factors, un corresponent a cada condició que ha canviat.

Fórmula de la solubilitat proteica

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ és la solubilitat coneguda de la proteïna en aigua en les condicions de referència, en mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, on $pI$ és el punt isoelèctric de la proteïna. La solubilitat és mínima en el punt isoelèctric i augmenta a mesura que el pH se n’allunya, fins a estabilitzar-se al cap d’un parell d’unitats de pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, on $I$ és la força iònica en mols per litre. Amb nivells baixos de sal, aquest terme incrementa lleugerament la solubilitat (efecte de salting-in). Amb nivells alts de sal, la disminueix (efecte de salting-out).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, on $T_m$ és el punt de fusió de la proteïna en °C. La solubilitat augmenta suaument amb la temperatura i després disminueix bruscament quan la temperatura s’acosta a $T_m$ i la proteïna comença a desplegar-se.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, on $\varepsilon$ és la constant dielèctrica del dissolvent. L’aigua té una constant dielèctrica de 78,4, de manera que aquest terme és igual a 1 en aigua. Els dissolvents que separen les càrregues amb menys eficàcia que l’aigua, com l’etanol, redueixen la solubilitat.

Valors de referència utilitzats per la calculadora

Categories de solubilitat

Exemple: albúmina en tampó fosfat

Calculeu la solubilitat de l’albúmina en tampó fosfat a 25 °C, pH 7,4 i una força iònica de 0,15 M.

Els valors de referència de l’albúmina són $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml i $T_m = 63°C$. El tampó fosfat té una constant dielèctrica de 76,0.

1. Terme del pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Ràtio: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Terme iònic: la força iònica (0,15 M) és igual al valor de referència, de manera que la ràtio és 1.
3. Terme de la temperatura: la temperatura (25 °C) és igual al valor de referència, de manera que la ràtio és 1.
4. Terme del dissolvent: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/ml}$

La calculadora indica 492,12 mg/ml, que correspon a la categoria «molt soluble».

Exemple: lisozim en glicerol a baixa temperatura

Calculeu la solubilitat del lisozim en una solució de glicerol a 4 °C, pH 5,0 i una força iònica de 0,1 M. Són unes condicions similars a les de l’emmagatzematge en fred d’un enzim.

Els valors de referència del lisozim són $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/ml i $T_m = 72°C$. El glicerol té una constant dielèctrica de 42,5.

1. Terme del pH: passar del pH 7,0 al pH 5,0 (tots dos molt per sota del pI de 11,35) només modifica lleugerament el terme del pH. Ràtio: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Terme iònic: reduir la força iònica de 0,15 M a 0,1 M augmenta lleugerament la solubilitat per l’efecte de «salting in». Ràtio: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Terme de temperatura: el refredament de 25 °C a 4 °C, molt per sota del punt de fusió, redueix el terme. Relació: 0,8106 USD$.
4. Terme del dissolvent: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/ml}$

La calculadora indica 35,88 mg/ml, que correspon a la categoria «soluble». La constant dielèctrica baixa del glicerol, i no pas la temperatura freda, és el que fa baixar el resultat respecte del valor de referència.

Com utilitzar la calculadora de solubilitat proteica

1. Trieu una proteïna de la llista: albúmina, insulina, lisozim, hemoglobina, mioglobina, col·lagen, caseïna o fibrinogen.
2. Trieu un dissolvent: aigua, tampó fosfat, tampó Tris, glicerol, DMSO, metanol, etanol o acetona.
3. Introduïu la temperatura en °C (de 0 a 100), el pH (de 0 a 14) i la força iònica en molar (de 0 a 2).
4. Llegiu la solubilitat calculada en mg/ml i la seva categoria. Una barra sota el resultat mostra el valor en una escala de 0 a 100 mg/ml i s’omple completament a partir de 100 mg/ml.

Factors que afecten la solubilitat de les proteïnes

El pH i el punt isoelèctric. Tota proteïna té un punt isoelèctric, el pH al qual la seva superfície no té càrrega elèctrica neta. En aquest pH, les molècules de proteïna no es repel·leixen entre si, de manera que s’agrupen i surten de la solució amb més facilitat. Allunyar el pH del punt isoelèctric, en qualsevol direcció, dona a la proteïna una càrrega neta. Les molècules carregades es repel·leixen, cosa que les manté separades i dissoltes.

La força iònica. Els ions de sal dissolts envolten els grups carregats de la superfície d’una proteïna. A concentracions baixes o moderades, aquests ions protegeixen les càrregues que altrament atraurien dues molècules de proteïna, fet que augmenta la solubilitat. Aquest fenomen s’anomena «salting in». A concentracions altes de sal, els ions competeixen amb la proteïna per les molècules d’aigua i eliminen la capa d’aigua que manté la proteïna dissolta. Aquest fenomen s’anomena «salting out» i és la base d’un mètode de purificació habitual que utilitza sulfat d’amoni per precipitar les proteïnes d’una mescla.

La temperatura. Escalfar una solució generalment augmenta la solubilitat fins a un cert punt. Quan la temperatura s’acosta al punt de fusió d’una proteïna, aquesta comença a desplegar-se. El desplegament exposa seccions hidrofòbiques (que repel·leixen l’aigua) de la proteïna que normalment queden ocultes dins de la seva estructura plegada. Aquestes seccions exposades s’adhereixen entre si i provoquen agregació, de manera que la solubilitat disminueix bruscament a prop del punt de fusió i per sobre d’aquest.

El dissolvent. La constant dielèctrica d’un dissolvent mesura amb quina eficàcia debilita l’atracció elèctrica entre partícules carregades. L’aigua té una constant dielèctrica alta i separa bé les càrregues, per això la majoria de proteïnes s’hi dissolen millor que en dissolvents orgànics com l’etanol o l’acetona. Els dissolvents amb una constant dielèctrica baixa permeten que les càrregues oposades de molècules de proteïna diferents s’atraiguin amb més força i afavoreixen l’agregació.

Limitacions

La calculadora utilitza un model simplificat basat en un conjunt reduït de proteïnes de referència i dissolvents estàndard. No té en compte la puresa de la proteïna, els additius com els detergents o els estabilitzadors ni els components de tampó inusuals. Els resultats són estimacions per planificar experiments, no un substitut de la mesura directa de la solubilitat al laboratori.

Preguntes més freqüents

Què és la solubilitat d’una proteïna? La solubilitat d’una proteïna és la concentració màxima de proteïna que es manté completament dissolta en un dissolvent, sense formar agregats visibles ni precipitat.

Per què una proteïna és menys soluble en el seu punt isoelèctric? En el punt isoelèctric, la proteïna no té càrrega elèctrica neta, de manera que les molècules de proteïna deixen de repel·lir-se elèctricament. Sense aquesta repulsió, és més probable que s’adhereixin entre si i surtin de la solució.

Quina diferència hi ha entre «salting in» i «salting out»? El «salting in» es produeix a concentracions baixes de sal, quan els ions dissolts protegeixen els grups carregats de la proteïna entre si i augmenten la solubilitat. El «salting out» es produeix a concentracions altes de sal, quan els ions retiren l’aigua de la superfície de la proteïna i redueixen la solubilitat.

Una temperatura més alta sempre augmenta la solubilitat? No. La solubilitat tendeix a augmentar amb la temperatura només fins a un cert punt. Quan la temperatura s’acosta al punt de fusió d’una proteïna, aquesta comença a desplegar-se, cosa que sol provocar agregació i una disminució brusca de la solubilitat.

Per què les proteïnes es dissolen menys en etanol o acetona que en aigua? L’aigua té una constant dielèctrica alta, és a dir, debilita amb molta eficàcia l’atracció elèctrica entre les parts carregades de les molècules de proteïna. L’etanol i l’acetona tenen constants dielèctriques més baixes, de manera que els grups carregats de molècules de proteïna diferents s’atrauen amb més força en aquests dissolvents i l’agregació és més probable.

Quina precisió té aquesta calculadora? Ofereix una estimació basada en un model físic i en un conjunt reduït de proteïnes i dissolvents de referència. És útil per acotar les condicions que cal provar, però la mesura experimental continua sent l’única manera de confirmar la solubilitat d’una mostra concreta de proteïna.

Bibliografia complementària

• Arakawa, T., i Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., i Pace, C. N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., i Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.