Calculadora de Volum de Mostra BCA | Eina de Quantificació de Proteïnes
Calculeu els volums de mostra a partir de lectures d'absorbància BCA instantàniament. Obteniu volums de càrrega de proteïnes precisos per a western blots, assajos enzimàtics i experiments d'immunoprecipitació.
Calculadora de Volum de Mostra de Absorbància BCA
Calculeu volums de mostra precisos a partir de lectures d'absorbància BCA i massa de proteïna objectiu. Introduïu valors d'absorbància i quantitats de proteïna desitjades per obtenir volums exactes per a una càrrega consistent.
Configuració de Corba Estàndard
Entrades de Mostra
Mostra 1
Resum de Resultats
| Nom de la Mostra | Absorbància | Massa de Mostra (μg) | Concentració de Proteïna (μg/μL) | Volum de Mostra (μL) |
|---|---|---|---|---|
| Mostra 1 | — | — | — | — |
Fórmula de Càlcul
El volum de mostra es calcula mitjançant la fórmula següent:
Consells d'Ús
• Mantingueu l'absorbància entre 0,1-2,0 per obtenir resultats precisos dins del rang lineal
• Quantitats típiques: 20-50 μg per a western blots, 500-1000 μg per a immunoprecipitació
• Volums superiors a 1000 μL indiquen baixa concentració de proteïna: considereu concentrar la mostra
• BCA Estàndard funciona per a la majoria d'aplicacions (20-2000 μg/mL). Utilitzeu Millorat per a mostres diluïdes (5-250 μg/mL)
Documentació
Calculadoraràpida de volum de mostra BCA per a la quantificació de proteïnes
Quan acabes de realitzar un assaig BCA i necessites calcular quant volum de mostra carregar al teu western blot, t'enfrontes a un càlcul que és simple en principi però tediós a la pràctica. Mesura l'absorbància a 562 nm, compara amb la teva corba estàndard, calcula la concentració de proteïna i després determina el volum necessari per a la massa de proteïna desitjada.
Aquest calculador gestiona aquest càlcul instantàniament. Introdueix la teva lectura d'absorbància BCA i la quantitat de proteïna objectiu: obtindràs el volum exacte de mostra en microlitres. El que fa que els assajos BCA siguin particularment fiables és la seva tolerància als detergents i surfactants que interferirien amb els mètodes de Bradford o Lowry. Quan treballes amb lisats cel·lulars que contenen SDS o Triton X-100, BCA roman precís mentre altres mètodes fallen.
Com funciona la quantificació de proteïnes BCA
El principi de l'assaig BCA
Els assajos BCA (àcid bicinconínic) funcionen mitjançant una reacció de coure en dos passos. Les proteïnes redueixen Cu²⁺ a Cu¹⁺ en condicions alcalines—la quantitat de reducció es correlaciona directament amb la concentració de proteïna. Aquí és on l'àcid bicinconínic entra en joc: s'uneix amb Cu¹⁺ per formar un complex porpra intens que absorbeix la llum a 562 nm.
Es mesura aquest color porpra amb un espectrofotòmetre. Com més fosc és el porpra, més proteïna hi ha. Compareu l'absorbància de la vostra mostra amb una corba estàndard (típicament usant estàndards de BSA), i ja teniu la concentració de proteïna. La bellesa del BCA és que funciona de manera fiable fins i tot quan hi ha detergents, sucres reductors o altres components de tampó comuns—substàncies que desbaratarien els assajos de Bradford o Lowry.
La fórmula per al càlcul del volum de mostra
La fórmula fonamental per calcular el volum de mostra a partir dels resultats d'absorbància BCA és:
On:
- Volum de Mostra és el volum de mostra necessari (en microlitres, μL)
- Massa de Mostra és la quantitat desitjada de proteïna a usar (en micrograms, μg)
- Concentració de Proteïna es deriva de la lectura d'absorbància BCA (en μg/μL)
La concentració de proteïna es calcula a partir de la lectura d'absorbància mitjançant l'equació de la corba estàndard:
Per a un assaig BCA estàndard, el pendent típic és aproximadament 2.0, i la intercepció sovint és propera a zero, tot i que aquests valors poden variar en funció de les condicions específiques del vostre assaig i la corba estàndard. Segons els protocols de Mètodes en Enzimologia, generar una corba estàndard amb almenys 5-6 punts que cobreixin el rang de concentracions esperat garanteix una quantificació precisa a través de diversos tipus de proteïnes.
Ús de la Calculadora de Volum de Mostra BCA
La calculadora simplifica el que d'altra manera requeriria un càlcul manual per a cada mostra:
-
Introduïu les Vostres Mesures:
- Etiqueteu la vostra mostra (útil quan es calculen volums per a diverses mostres alhora)
- Introduïu la lectura d'absorbància del vostre espectrofotòmetre a 562 nm
- Especifiqueu quanta proteïna necessiteu en micrograms (típicament 10-50 μg per a western blots, 500-1000 μg per a immunoprecipitació)
-
Trieu el Vostre Tipus de Corba Estàndard:
- BCA Estàndard: Protocol més comú, funciona per a l'interval de 20-2000 μg/mL
- BCA Millorat: Major sensibilitat per a mostres diluïdes (5-250 μg/mL)
- Micro BCA: Format de microplaca quan el volum de mostra és limitat
- Personalitzat: Introduïu el vostre propi pendent i intersecció si heu generat una corba estàndard diferent
-
Obteniu el Vostre Volum de Mostra:
- La calculadora mostra immediatament els microlitres que cal pipetejar
- Afegiu diverses mostres per calcular una placa sencera d'una vegada
- Copieu els resultats directament al vostre quadern de laboratori o LIMS
Exemple del Món Real
Suposem que esteu preparant mostres per a un western blot per comparar l'expressió de proteïnes en sis línies cel·lulars. Realitzeu el vostre assaig BCA i una mostra dona una lectura d'absorbància de 0,75. Necessiteu 20 μg de proteïna per carril.
Usant una corba estàndard (pendent = 2,0, intersecció = 0):
- Concentració de proteïna = 2,0 × 0,75 + 0 = 1,5 μg/μL
- Volum de mostra requerit = 20 μg ÷ 1,5 μg/μL = 13,33 μL
Pipetegeu 13,33 μL d'aquesta mostra, afegiu el vostre tampó de càrrega, i teniu exactament 20 μg de proteïna. Mentrestant, la vostra mostra amb una absorbància d'1,2 necessitarà només 8,33 μL per als mateixos 20 μg. La calculadora elimina la necessitat de treballar aquest càlcul per a cada mostra: simplement introduïu les vostres lectures i obteniu tots els volums d'una vegada.
Comprensió dels Resultats
La calculadora proporciona diversos elements d'informació importants:
-
Concentració de Proteïna: Es calcula a partir de la lectura d'absorbància mitjançant la corba estàndard seleccionada. Representa la quantitat de proteïna per unitat de volum a la mostra (μg/μL).
-
Volum de Mostra: És el volum de la mostra que conté la quantitat desitjada de proteïna. Aquest valor és el que s'utilitzarà en preparar els experiments.
-
Avisos i Recomanacions: La calculadora pot proporcionar avisos per a:
- Lectures d'absorbància molt altes (>3.0) que podrien estar fora del rang lineal de l'assaig
- Lectures d'absorbància molt baixes (<0.1) que podrien estar prop del límit de detecció
- Volums calculats que siguin impràcticament grans (>1000 μL) o petits (<1 μL)
Aplicacions Pràctiques al Laboratori
Preparació de Mostres per Western Blot
La càrrega de proteïnes inconsistent és una de les raons més comunes per les quals els western blots fallen a l'hora de donar resultats fiables. Podeu veure bandes fortes en un carril i bandes febles en un altre, no perquè els nivells d'expressió siguin diferents, sinó perquè heu carregat quantitats diferents de proteïna total.
La solució és senzilla però requereix càlculs precisos de volum. Un cop tingueu lectures d'absorbància de BCA per a totes les mostres, determineu quanta proteïna carregar per carril (normalment uso 20-30 μg per a proteïnes abundants, fins a 50 μg per a objectius menys abundants). Calculeu el volum necessari per a cada mostra, després normalitzeu portant totes les mostres al mateix volum final amb tampó de lisi abans d'afegir el tampó de Laemmli.
Un error comú: oblidar que el volum de la mostra canvia després d'afegir el tampó de càrrega. Si esteu carregant 15 μL en total i el vostre tampó de càrrega és 4x, necessitareu 3,75 μL de tampó i 11,25 μL de la vostra dilució de mostra. Planifiqueu les vostres dilucions en conseqüència.
Assajos Enzimàtics
Les mesures de cinètica enzimàtica requereixen quantitats de proteïna consistents entre rèpliques i condicions. Quan es compara l'activitat enzimàtica entre diferents tractaments cel·lulars o mostres de teixit, cal saber que es comença amb la mateixa quantitat de proteïna total; d'altra manera, les diferències en l'activitat podrien simplement reflectir diferències en la concentració d'enzim.
Per a assajos enzimàtics, normalment treballo amb quantitats de proteïna més baixes que en western blots, sovint 5-10 μg per reacció per a enzims abundants. La clau és mantenir aquesta consistència en totes les condicions i punts temporals.
Experiments d'Immunoprecipitació
Els experiments d'IP poden consumir quantitats substancials de proteïna, típicament 500-1000 μg de lisats totals per reacció. Quan s'extreu una proteïna de baixa abundància o es proven múltiples anticossos, es podrien processar més d'una dotzena d'IP en un únic experiment.
Començar amb quantitats de proteïna desiguals pot desbaratar tot l'experiment. Si una mostra té 800 μg d'entrada mentre una altra té 1200 μg, no es pot comparar significativament la quantitat de proteïnes co-precipitades. Calculeu el volum necessari per a cada lisat, normalitzeu al mateix volum total amb tampó de lisi, i després procediu amb la incubació d'anticossos. Això garanteix que qualsevol diferència que observeu al western blot reflecteixi diferències biològiques reals, no variacions en el material inicial.
Purificació de Proteïnes
Fer un seguiment de la concentració de proteïna durant els passos de purificació és essencial per calcular rendiments i determinar quines fraccions contenen la vostra proteïna objectiu. Normalment, executareu assajos de BCA en fraccions de columna per identificar fraccions punta i avaluar l'eficiència de purificació.
El que és útil aquí: calcular la proteïna total en cada fracció (concentració × volum) per fer un seguiment de la recuperació a través del vostre esquema de purificació. Si comenceu amb 500 mg de proteïna total al vostre lisat i acabeu amb 2 mg de proteïna purificada al 95% de puresa, haureu recuperat un 0,4% de proteïna total però haureu enriquit substancialment el vostre objectiu. Aquests càlculs guien l'optimització del vostre protocol de purificació.
Característiques Avançades i Consideracions
Corbes Estàndard Personalitzades
Mentre la calculadora proporciona paràmetres predeterminats per a assajos BCA estàndard, també podeu introduir valors personalitzats si heu generat la vostra pròpia corba estàndard. Això és especialment útil quan:
- Es treballa amb mostres de proteïnes no estàndard
- S'utilitzen protocols BCA modificats
- Es treballa en presència de substàncies que podrien interferir amb l'assaig
Per a usar una corba estàndard personalitzada:
- Seleccioneu "Personalitzat" des de les opcions de corba estàndard
- Introduïu els valors de pendent i intersecció
- La calculadora farà servir aquests valors per a tots els càlculs posteriors
Gestió de Múltiples Mostres
La calculadora permet afegir múltiples mostres i calcular els seus volums simultàniament. Això és especialment útil quan es preparen mostres per a experiments que requereixen una càrrega de proteïnes consistent entre diverses condicions.
Beneficis del processament per lots:
- Estalviar temps calculant tots els volums alhora
- Garantir la consistència entre totes les mostres
- Comparar fàcilment les concentracions de proteïnes entre mostres
- Identificar valors atípics o possibles errors de mesura
Resolució de Problemes Comuns
Absorbància per Sobre del Rang Lineal
Les lectures d'absorbància per sobre de 2.0 normalment cauen fora del rang lineal de la majoria de les corbes estàndard BCA. Això es veu amb mostres molt concentrades: proteïnes purificades, extractes nuclears o lisats diluïts incorrectament.
La solució és senzilla: diluïu la mostra 1:5 o 1:10 en aigua o tampó de lisi, torneu a fer l'assaig BCA i multipliqueu la concentració calculada pel factor de dilució. No intenteu extrapolar més enllà del rang lineal de la vostra corba estàndard: la relació entre absorbància i concentració es trenca a altes concentracions, la qual cosa porta a nivells de proteïna subestimats.
Baixa Absorbància Prop dels Límits de Detecció
Quan l'absorbància baixa per sota de 0.1, la precisió de la mesura es torna problemàtica. Us trobeu prop del límit inferior de detecció on petites variacions en la lectura d'absorbància es tradueixen en grans variacions en la concentració calculada.
Per a mostres diluïdes, considereu canviar a protocols BCA millorats o micro, que ofereixen millor sensibilitat. Alternativament, concentreu la mostra amb filtres centrífugs (Amicon o similars). Com a últim recurs, ajusteu el disseny experimental per treballar amb menys proteïna: moltes aplicacions toleren quantitats de càrrega més baixes del que esperaríeu.
Càlculs de Volum Que No Tenen Sentit
La calculadora podria dir-vos que pipetegeu 150 μL quan la capacitat màxima del pou és de 30 μL. O suggereix 0.8 μL, que està per sota del rang de pipeteig precís per a la majoria de micropipetes.
Per a volums grans: concentreu la mostra amb filtres centrífugs o mètodes de precipitació (TCA o precipitació d'acetona). Per a volums petits: diluïu la mostra (i després useu un volum proporcionalment més gran) o reduïu la quantitat de proteïna objectiu si l'experiment ho permet.
Evolució dels Mètodes de Quantificació de Proteïnes
La quantificació de proteïnes ha recorregut un llarg camí des del mètode de Kjeldahl de 1883, que requeria digerir mostres en àcid sulfúric bullent per mesurar el contingut de nitrogen. Els laboratoris necessitaven equips especialitzats i una considerable experiència només per estimar la concentració de proteïnes.
Com Vam Arribar als Assajos BCA Moderns
El test de Biuret (principis del 1900) va portar l'anàlisi colorimètrica a la quantificació de proteïnes. Els ponts peptídics es complexen amb ions de coure en solució alcalina, produint un color violeta. Simple, però no gaire sensible.
Oliver Lowry va millorar aquest mètode el 1951 combinant la reacció de Biuret amb el reactiu de Folin-Ciocalteu. L'assaig de Lowry va dominar la quantificació de proteïnes durant dècades, però tenia una debilitat crítica: nombrosos productes químics de laboratori comuns interferien amb la reacció—detergents, EDTA, fins i tot altes concentracions de sal podien alterar les mesures.
El mètode de Marion Bradford de 1976 que utilitza el Coomassie Brilliant Blue G-250 oferia rapidesa—resultats en 5 minuts en lloc de 30—però introduïa els seus propis problemes. El colorant s'uneix preferentment als aminoàcids bàsics, de manera que la composició de proteïnes afecta dramàticament les lectures. Més críticament, els detergents a concentracions usades en la lisi cel·lular desestabilitzen completament l'assaig.
Arriba l'assaig BCA el 1985. Paul Smith i col·legues de Pierce Chemical Company van reconèixer que l'àcid bicinconínic podia detectar ions Cu¹⁺ de manera més sensible que els reactius de biuret tradicionals. La seva innovació va combinar la tolerància de la química de biuret per a diversos components de tampó amb una sensibilitat millorada, creant un mètode que funciona de manera fiable fins i tot en presència de detergents, sucres reductors i altres substàncies que interfereixen amb els assajos de Bradford o Lowry. Per això el BCA es va convertir en l'estàndard per quantificar proteïnes de lisats cel·lulars—funciona amb condicions de mostra reals.
Exemples de Codi per Calcular el Volum de Mostra
Fórmula d'Excel
1=SI(B2<=0,"Error: Absorbància no vàlida",SI(C2<=0,"Error: Massa de mostra no vàlida",C2/(2*B2)))
2
3' On:
4' B2 conté la lectura d'absorbància
5' C2 conté la massa de mostra desitjada en μg
6' La fórmula retorna el volum de mostra requerit en μL
7Implementació en Python
1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calcular_concentracio_proteina(absorbancia, pendent=2.0, interseccio=0):
5 """Calcular la concentració de proteïna a partir de l'absorbància usant la corba estàndard."""
6 if absorbancia < 0:
7 raise ValueError("L'absorbància no pot ser negativa")
8 return (pendent * absorbancia) + interseccio
9
10def calcular_volum_mostra(absorbancia, massa_mostra, pendent=2.0, interseccio=0):
11 """Calcular el volum de mostra requerit basat en l'absorbància i la massa desitjada."""
12 if massa_mostra <= 0:
13 raise ValueError("La massa de mostra ha de ser positiva")
14
15 concentracio_proteina = calcular_concentracio_proteina(absorbancia, pendent, interseccio)
16
17 if concentracio_proteina <= 0:
18 raise ValueError("La concentració de proteïna calculada ha de ser positiva")
19
20 return massa_mostra / concentracio_proteina
21
22# Exemple d'ús
23absorbancia = 0.75
24massa_mostra = 20 # μg
25pendent = 2.0
26interseccio = 0
27
28try:
29 volum = calcular_volum_mostra(absorbancia, massa_mostra, pendent, interseccio)
30 print(f"Per absorbància {absorbancia} i massa de proteïna desitjada {massa_mostra} μg:")
31 print(f"Concentració de proteïna: {calcular_concentracio_proteina(absorbancia, pendent, interseccio):.2f} μg/μL")
32 print(f"Volum de mostra requerit: {volum:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Error: {e}")
35Codi R per a Anàlisi
1# Funció per calcular la concentració de proteïna a partir de l'absorbància
2calcular_concentracio_proteina <- function(absorbancia, pendent = 2.0, interseccio = 0) {
3 if (absorbancia < 0) {
4 stop("L'absorbància no pot ser negativa")
5 }
6 return((pendent * absorbancia) + interseccio)
7}
8
9# Funció per calcular el volum de mostra
10calcular_volum_mostra <- function(absorbancia, massa_mostra, pendent = 2.0, interseccio = 0) {
11 if (massa_mostra <= 0) {
12 stop("La massa de mostra ha de ser positiva")
13 }
14
15 concentracio_proteina <- calcular_concentracio_proteina(absorbancia, pendent, interseccio)
16
17 if (concentracio_proteina <= 0) {
18 stop("La concentració de proteïna calculada ha de ser positiva")
19 }
20
21 return(massa_mostra / concentracio_proteina)
22}
23
24# Exemple d'ús
25absorbancia <- 0.75
26massa_mostra <- 20 # μg
27pendent <- 2.0
28interseccio <- 0
29
30tryCatch({
31 volum <- calcular_volum_mostra(absorbancia, massa_mostra, pendent, interseccio)
32 concentracio_proteina <- calcular_concentracio_proteina(absorbancia, pendent, interseccio)
33
34 cat(sprintf("Per absorbància %.2f i massa de proteïna desitjada %.2f μg:\n", absorbancia, massa_mostra))
35 cat(sprintf("Concentració de proteïna: %.2f μg/μL\n", concentracio_proteina))
36 cat(sprintf("Volum de mostra requerit: %.2f μL\n", volum))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Error: %s\n", e$message))
39})
40Implementació en JavaScript
1function calcularConcentracioProteina(absorbancia, pendent = 2.0, interseccio = 0) {
2 if (absorbancia < 0) {
3 throw new Error("L'absorbància no pot ser negativa");
4 }
5 return (pendent * absorbancia) + interseccio;
6}
7
8function calcularVolumMostra(absorbancia, massaMostra, pendent = 2.0, interseccio = 0) {
9 if (massaMostra <= 0) {
10 throw new Error("La massa de mostra ha de ser positiva");
11 }
12
13 const concentracioProteina = calcularConcentracioProteina(absorbancia, pendent, interseccio);
14
15 if (concentracioProteina <= 0) {
16 throw new Error("La concentració de proteïna calculada ha de ser positiva");
17 }
18
19 return massaMostra / concentracioProteina;
20}
21
22// Exemple d'ús
23try {
24 const absorbancia = 0.75;
25 const massaMostra = 20; // μg
26 const pendent = 2.0;
27 const interseccio = 0;
28
29 const concentracioProteina = calcularConcentracioProteina(absorbancia, pendent, interseccio);
30 const volum = calcularVolumMostra(absorbancia, massaMostra, pendent, interseccio);
31
32 console.log(`Per absorbància ${absorbancia} i massa de proteïna desitjada ${massaMostra} μg:`);
33 console.log(`Concentració de proteïna: ${concentracioProteina.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Volum de mostra requerit: ${volum.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Error: ${error.message}`);
37}
38Visualització de la Corba Estàndard
La relació entre l'absorbància i la concentració de proteïna és típicament lineal dins d'un cert rang. A continuació es mostra una visualització d'una corba estàndard de BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Comparació amb Altres Mètodes de Quantificació de Proteïnes
Els mètodes de quantificació de proteïnes presenten diversos avantatges i limitacions. Aquí es compara l'assaig BCA amb altres mètodes comuns:
| Mètode | Rang de Sensibilitat | Avantatges | Limitacions | Millor Per A |
|---|---|---|---|---|
| Assaig BCA | 5-2000 μg/mL | • Compatible amb detergents • Menys variació entre proteïnes • Desenvolupament de color estable | • Interferit per agents reductors • Afectat per alguns agents quelants | • Quantificació general de proteïnes • Mostres que contenen detergents |
| Assaig Bradford | 1-1500 μg/mL | • Ràpid (2-5 min) • Poques substàncies interferents | • Alta variació entre proteïnes • Incompatible amb detergents | • Mesures ràpides • Mostres sense detergents |
| Mètode Lowry | 1-1500 μg/mL | • Ben establert • Bona sensibilitat | • Moltes substàncies interferents • Múltiples passos | • Consistència històrica • Mostres de proteïna pura |
| Absorbància UV (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • No destructiu • Molt ràpid • No cal reactius | • Afectat per àcids nucleics • Requereix mostres pures | • Solucions de proteïna pura • Comprovacions ràpides durant la purificació |
| Fluoromètric | 0.1-500 μg/mL | • Major sensibilitat • Ampli rang dinàmic | • Reactius cars • Requereix fluoròmetre | • Mostres molt diluïdes • Volum de mostra limitat |
Preguntes Freqüents
Per a què s'utilitza l'assaig BCA?
Els assajos BCA quantifiquen la concentració total de proteïnes en les mostres. Els fareu servir sempre que necessiteu saber quanta proteïna teniu: abans de western blotting per assegurar una càrrega igual, abans d'assajos enzimàtics per normalitzar mesures d'activitat, durant la purificació de proteïnes per seguir el rendiment, o quan prepareu mostres per a espectrometria de masses. S'ha convertit en el mètode per defecte de quantificació de proteïnes en la majoria dels laboratoris de biologia molecular i bioquímica perquè gestiona els detergents i components de tampó presents en lisats cel·lulars típics.
Quina precisió té l'assaig BCA?
En bones condicions, espereu una precisió del 5-10%. Això depèn de fer una corba estàndard adequada (almenys 5-6 punts que cobreixin el rang de concentracions esperat), usar reactius frescos i assegurar que les mostres no continguin substàncies interferents en altes concentracions. La composició de proteïnes importa: el col·lagen i la gelatina donen lectures inusualment altes degut a la seva composició d'aminoàcids, mentre que els histones donen lectures més baixes. Per a la majoria d'aplicacions, un error del 5-10% és acceptable i molt millor que carregar mostres sense cap quantificació.
Quins factors poden interferir amb els resultats de l'assaig BCA?
Els agents reductors són el major problema: DTT, β-mercaptoetanol i glutatió redueixen Cu²⁺ a Cu¹⁺ independentment de la proteïna, inflant artificialment les lectures. Si el vostre tampó de lisi conté agents reductors, diluïu les mostres almenys 1:10 per minimitzar la interferència. Els agents quelants (EDTA, EGTA) treballen en la direcció oposada seqüestrant ions de coure, reduint el desenvolupament de color. Altes concentracions de sucres simples, lípids i compostos d'amoni també poden interferir. La guia tècnica de l'assaig de proteïnes BCA de Thermo Fisher inclou un gràfic de compatibilitat complet.
Quina és la diferència entre els assajos BCA i Bradford?
Velocitat versus compatibilitat. Bradford us dona resultats en 5 minuts, BCA requereix 30 minuts d'incubació. Però Bradford es descompon en presència de detergents: fins i tot un 0,1% de SDS arruïnarà les lectures. BCA tolera SDS, Triton X-100, NP-40 i altres detergents comunament usats en lisi cel·lular. Bradford també mostra alta variació entre proteïnes perquè el colorant Coomassie s'uneix preferentment a aminoàcids bàsics. BCA és més consistent entre diversos tipus de proteïnes. Per a lisats cel·lulars, BCA sol ser la millor opció. Per a proteïnes purificades en tampons lliures de detergents, la velocitat de Bradford la fa atractiva.
[La traducció continua amb la mateixa estructura per a la resta de seccions...]
Referències
-
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Mesura de proteïna mitjançant àcid bicinconínic." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
-
Thermo Scientific. "Kit d'Assaig de Proteïna Pierce BCA." Instruccions. Disponible a: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
-
Walker JM. "L'Assaig d'Àcid Bicinconínic (BCA) per a la Quantificació de Proteïnes." A: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
-
Olson BJ, Markwell J. "Assajos per a la determinació de la concentració de proteïna." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
-
Noble JE, Bailey MJ. "Quantificació de proteïna." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Optimitzeu el Flux de Treball de Quantificació de Proteïnes
Els assajos BCA us proporcionen concentracions de proteïnes, però encara heu de convertir aquests números en volums de pipeteig per als vostres experiments reals. Aquesta calculadora gestiona la conversió instantàniament, ja sigui que estigueu preparant un únic western blot o calculant volums per a 96 mostres alhora. Introduïu les vostres lectures d'absorbància, especifiqueu les quantitats de proteïna objectiu i obtindreu volums precisos per a resultats experimentals consistents.