Calculeu volums de mostra precisos basats en les lectures d'absorció de l'assaig BCA i la massa de proteïna desitjada. Essencial per a una càrrega de proteïna consistent en blots occidentals i altres aplicacions de laboratori.
Aquesta eina calcula el volum de mostra necessari en funció dels resultats d'absorbància BCA i la massa de la mostra. Introduïu el valor d'absorbància i la massa de la mostra per a cada mostra per calcular el volum de mostra corresponent.
El volum de la mostra es calcula utilitzant la següent fórmula:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
El Calculador de Volum de Mostra d'Absorbància BCA és una eina especialitzada dissenyada per ajudar investigadors i tècnics de laboratori a determinar amb precisió el volum de mostra apropiat per a experiments basats en els resultats de l'assaig BCA (àcid bicinchoninic). Aquest calculador pren les lectures d'absorbància del vostre assaig BCA i la massa de mostra desitjada per calcular el volum precís necessari per a una càrrega de proteïna consistent en aplicacions com la transferència western, assaigs enzimàtics i altres tècniques d'anàlisi de proteïnes.
L'assaig BCA és un dels mètodes més utilitzats per a la quantificació de proteïnes en laboratoris de bioquímica i biologia molecular. Mesurant l'absorbància de les vostres mostres de proteïna i comparant-les amb una corba estàndard, podeu determinar la concentració de proteïna amb alta precisió. El nostre calculador simplifica aquest procés convertint automàticament les lectures d'absorbància en els volums exactes de mostra necessaris per als vostres experiments.
L'assaig d'Àcid Bicinchoninic (BCA) és un assaig bioquímic per determinar la concentració total de proteïnes en una solució. El principi d'aquest assaig es basa en la formació d'un complex Cu²⁺-proteïna en condicions alcalines, seguit de la reducció de Cu²⁺ a Cu¹⁺. La quantitat de reducció és proporcional a la proteïna present. El BCA forma un complex de color morat amb Cu¹⁺ en entorns alcalins, proporcionant una base per monitorar la reducció del coure per les proteïnes.
La intensitat del color morat augmenta proporcionalment amb la concentració de proteïna, la qual es pot mesurar mitjançant un espectrofotòmetre a aproximadament 562 nm. Les lectures d'absorbància es comparen amb una corba estàndard per determinar la concentració de proteïna en mostres desconegudes.
La fórmula fonamental per calcular el volum de mostra a partir dels resultats d'absorbància BCA és:
On:
La concentració de proteïna es calcula a partir de la lectura d'absorbància mitjançant l'equació de la corba estàndard:
Per a un assaig BCA estàndard, la pendent típica és aproximadament 2.0, i la interceptació sovint és a prop de zero, tot i que aquests valors poden variar en funció de les condicions específiques del vostre assaig i la corba estàndard.
El nostre calculador simplifica el procés de determinació dels volums de mostra a partir dels resultats de l'assaig BCA. Seguiu aquests passos per obtenir càlculs precisos:
Introduïu la Informació de la Mostra:
Seleccioneu el Tipus de Corba Estàndard:
Veure Resultats:
Copiar o Exportar Resultats:
Fem un exemple pràctic:
Això significa que heu de carregar 13.33 μL de la vostra mostra per obtenir 20 μg de proteïna.
El calculador proporciona diverses peces d'informació importants:
Concentració de Proteïna: Aquesta es calcula a partir de la vostra lectura d'absorbància utilitzant la corba estàndard seleccionada. Representa la quantitat de proteïna per unitat de volum en la vostra mostra (μg/μL).
Volum de Mostra: Aquest és el volum de la vostra mostra que conté la quantitat desitjada de proteïna. Aquest valor és el que utilitzareu quan prepareu els vostres experiments.
Advertències i Recomanacions: El calculador pot proporcionar advertències per:
Una de les aplicacions més comunes per a aquest calculador és la preparació de mostres per a la transferència western. La càrrega consistent de proteïna és crucial per a resultats fiables en la transferència western, i aquest calculador assegura que carregueu la mateixa quantitat de proteïna per a cada mostra, fins i tot quan les seves concentracions difereixen.
Flux de treball d'exemple:
Per als assaigs enzimàtics, sovint és necessari utilitzar una quantitat específica de proteïna per estandarditzar les condicions de reacció entre diferents mostres o experiments.
Flux de treball d'exemple:
En experiments d'immunoprecipitació (IP), començar amb una quantitat consistent de proteïna és important per comparar resultats entre diferents condicions.
Flux de treball d'exemple:
Durant la purificació de proteïnes, sovint és necessari fer un seguiment de la concentració de proteïna i calcular els rendiments en diferents passos.
Flux de treball d'exemple:
Si bé el calculador proporciona paràmetres predeterminats per a assaigs BCA estàndard, també podeu introduir valors personalitzats si heu generat la vostra pròpia corba estàndard. Això és particularment útil quan:
Per utilitzar una corba estàndard personalitzada:
El calculador us permet afegir múltiples mostres i calcular els seus volums simultàniament. Això és especialment útil quan es preparen mostres per a experiments que requereixen una càrrega de proteïna consistent entre diverses condicions.
Beneficis del processament en massa:
Si la vostra lectura d'absorbància és superior a 2.0, pot estar fora de l'abast lineal de l'assaig BCA. En aquests casos:
Per a lectures d'absorbància per sota de 0.1, podeu estar a prop del límit de detecció de l'assaig, la qual cosa podria afectar l'exactitud. Considereu:
Si el calculador suggereix un volum que és massa gran per a la vostra aplicació:
La quantificació precisa de proteïnes ha estat un requisit fonamental en bioquímica i biologia molecular des que van emergir aquests camps. Els primers mètodes es basaven en la determinació del contingut de nitrogen, que era laboriós i requerien equipament especialitzat.
Mètode Kjeldahl (1883): Un dels primers mètodes per a la quantificació de proteïnes, basat en la mesura del contingut de nitrogen.
Test de Biuret (Principis del 1900): Aquest mètode es basa en la reacció entre els enllaços peptídics i els ions de coure en una solució alcalina, produint un color violeta.
Assaig de Lowry (1951): Desenvolupat per Oliver Lowry, aquest mètode combinava la reacció de Biuret amb el reactiu de Folin-Ciocalteu, augmentant la sensibilitat.
Assaig de Bradford (1976): Marion Bradford va desenvolupar aquest mètode utilitzant el colorant Coomassie Brilliant Blue G-250, que s'uneix a les proteïnes i desplaça el màxim d'absorció.
Assaig BCA (1985): Desenvolupat per Paul Smith i col·legues de Pierce Chemical Company, aquest mètode combinava la reacció de biuret amb la detecció BCA, oferint una sensibilitat millorada i compatibilitat amb detergents.
L'assaig BCA es va descriure per primera vegada en un article de 1985 de Smith et al. titulat "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Es va desenvolupar per abordar les limitacions dels mètodes existents, particularment la interferència de diverses substàncies químiques que s'utilitzaven comunament en l'extracció i purificació de proteïnes.
La clau de la innovació va ser l'ús de l'àcid bicinchoninic per detectar els ions Cu¹⁺ produïts per la reducció de Cu²⁺ mediada per proteïnes, formant un complex de color morat que es podia mesurar espectrofotomètricament. Això va proporcionar diversos avantatges:
Des de la seva introducció, l'assaig BCA s'ha convertit en un dels mètodes de quantificació de proteïnes més utilitzats en laboratoris de bioquímica i biologia molecular de tot el món.
1=IF(B2<=0,"Error: Absorbància no vàlida",IF(C2<=0,"Error: Massa de mostra no vàlida",C2/(2*B2)))
2
3' On:
4' B2 conté la lectura d'absorbància
5' C2 conté la massa de mostra desitjada en μg
6' La fórmula retorna el volum de mostra requerit en μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Calcular la concentració de proteïna a partir de l'absorbància utilitzant la corba estàndard."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("L'absorbància no pot ser negativa")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Calcular el volum de mostra requerit en funció de l'absorbància i la massa desitjada."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("La massa de mostra ha de ser positiva")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("La concentració de proteïna calculada ha de ser positiva")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Exemple d'ús
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Per a l'absorbància {absorbance} i la massa de proteïna desitjada {sample_mass} μg:")
31 print(f"Concentració de proteïna: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Volum de mostra requerit: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Error: {e}")
351# Funció per calcular la concentració de proteïna a partir de l'absorbància
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("L'absorbància no pot ser negativa")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funció per calcular el volum de mostra
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("La massa de mostra ha de ser positiva")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("La concentració de proteïna calculada ha de ser positiva")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Exemple d'ús
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Per a l'absorbància %.2f i la massa de proteïna desitjada %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Concentració de proteïna: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Volum de mostra requerit: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Error: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("L'absorbància no pot ser negativa");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("La massa de mostra ha de ser positiva");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("La concentració de proteïna calculada ha de ser positiva");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Exemple d'ús
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Per a l'absorbància ${absorbance} i la massa de proteïna desitjada ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Concentració de proteïna: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Volum de mostra requerit: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Error: ${error.message}`);
37}
38La relació entre l'absorbància i la concentració de proteïna és típicament lineal dins d'un cert rang. A continuació es presenta una visualització d'una corba estàndard BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Els diferents mètodes de quantificació de proteïnes tenen diverses avantatges i limitacions. Aquí teniu com l'assaig BCA es compara amb altres mètodes comuns:
| Mètode | Rang de Sensibilitat | Avantatges | Limitacions | Millor per |
|---|---|---|---|---|
| Assaig BCA | 5-2000 μg/mL | • Compatible amb detergents • Menys variació entre proteïnes • Desenvolupament de color estable | • Interferit per agents reductors • Afectat per alguns agents quelants | • Quantificació general de proteïnes • Mostres que contenen detergents |
| Assaig Bradford | 1-1500 μg/mL | • Ràpid (2-5 min) • Pocs substàncies interferents | • Alta variació entre proteïnes • Incompatible amb detergents | • Mesures ràpides • Mostres sense detergents |
| Mètode de Lowry | 1-1500 μg/mL | • Ben establert • Bona sensibilitat | • Moltes substàncies interferents • Múltiples passos | • Consistència històrica • Mostres de proteïna pura |
| Absorbància UV (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • No destructiu • Molt ràpid • Sense reactius necessaris | • Afectat per àcids nucleics • Requereix mostres pures | • Solucions de proteïna pura • Comprovacions ràpides durant la purificació |
| Fluoromètric | 0.1-500 μg/mL | • La sensibilitat més alta • Ampli rang dinàmic | • Reactius cars • Requereix fluoròmetre | • Mostres molt diluïdes • Volum de mostra limitat |
L'assaig BCA (àcid bicinchoninic) s'utilitza principalment per quantificar la concentració total de proteïnes en una mostra. S'utilitza àmpliament en bioquímica, biologia cel·lular i biologia molecular per a aplicacions com la transferència western, assaigs enzimàtics, immunoprecipitació i purificació de proteïnes.
L'assaig BCA és generalment precís dins del 5-10% quan es realitza correctament. La seva precisió depèn de diversos factors, incloent la qualitat de la corba estàndard, l'absència de substàncies interferents i si la composició de la proteïna desconeguda és similar a la proteïna estàndard utilitzada.
Diverses substàncies poden interferir amb els resultats de l'assaig BCA, incloent:
Les principals diferències són:
Si el vostre calculador mostra un volum de mostra molt gran, normalment indica una baixa concentració de proteïna a la vostra mostra. Això podria ser degut a:
Considereu concentrar la vostra mostra o ajustar el vostre disseny experimental per acomodar la concentració de proteïna més baixa.
Aquest calculador està dissenyat específicament per als resultats de l'assaig BCA. Si bé el principi bàsic (convertir concentració a volum) s'aplica a altres mètodes, la relació entre l'absorbància i la concentració de proteïna varia entre diferents assaigs. Per a altres mètodes com Bradford o Lowry, hauríeu d'utilitzar diferents paràmetres de corba estàndard.
Per a lectures d'absorbància fora de l'abast lineal (normalment >2.0):
L'albumina del sèrum boví (BSA) és el estàndard més utilitzat per als assaigs BCA perquè és:
Tanmateix, si les vostres mostres contenen una proteïna predominant que difereix significativament de la BSA, considereu utilitzar aquesta proteïna com a estàndard per a resultats més precisos.
El color morat desenvolupat en la reacció BCA és estable durant diverses hores a temperatura ambient i es pot mesurar en qualsevol moment dins d'aquest període. No obstant això, per a millors resultats, es recomana mesurar tots els estàndards i mostres aproximadament al mateix temps després del desenvolupament del color.
Si bé és tècnicament possible reutilitzar una corba estàndard, no es recomana per a una quantificació precisa. Les variacions en reactius, condicions d'incubació i calibratge d'instruments poden afectar la relació entre l'absorbància i la concentració de proteïna. Per a resultats fiables, genereu una nova corba estàndard cada vegada que realitzeu l'assaig.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instruccions. Disponible a: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Ara que enteneu els principis darrere de la quantificació de proteïnes BCA i el càlcul del volum de mostra, proveu el nostre calculador per agilitzar el vostre flux de treball de laboratori. Simplement introduïu les vostres lectures d'absorbància i la massa de mostra desitjada per obtenir càlculs instantanis i precisos del volum de mostra.
Ja sigui que esteu preparant mostres per a transferències western, assaigs enzimàtics o qualsevol altre experiment basat en proteïnes, el nostre calculador ajudarà a garantir resultats consistents i fiables. Estalvieu temps, reduïu errors i milloreu la reproductibilitat dels vostres experiments amb el Calculador de Volum de Mostra d'Absorbància BCA.
Descobreix més eines que podrien ser útils per al teu flux de treball