Calculadora de Volum de Mostra BCA | Eina de Quantificació de Proteïnes

Què és una calculadora del volum de mostra per a BCA

Una calculadora del volum de mostra per a BCA converteix una lectura d’absorbància d’un assaig de proteïnes BCA en el volum de mostra, en microlitres (μL), necessari per carregar una quantitat determinada de proteïna. S’utilitza després de fer un assaig de proteïnes amb àcid bicinconínic (BCA), una prova de laboratori habitual que mesura quanta proteïna hi ha en una solució a partir de la intensitat del color morat que absorbeix la llum i que desenvolupa la mostra.

Com mesura la proteïna l’assaig BCA

L’assaig BCA funciona en dos passos. Primer, la proteïna de la mostra redueix els ions de coure (Cu²⁺) a una forma diferent (Cu¹⁺) en una solució alcalina. El grau de reducció depèn de la quantitat de proteïna present. Després, l’àcid bicinconínic s’uneix al coure reduït i forma un compost morat que absorbeix intensament la llum a una longitud d’ona de 562 nanòmetres (nm).

Un espectrofotòmetre mesura quanta llum absorbeix la mostra a 562 nm. Aquest valor s’anomena absorbància. Un color morat més fosc indica una absorbància més alta i més proteïna. El laboratori compara l’absorbància de cada mostra amb una corba patró, elaborada mesurant concentracions conegudes d’una proteïna de referència, habitualment l’albúmina sèrica bovina (BSA).

El BCA és popular perquè continua funcionant quan una mostra conté detergents com l’SDS o el Triton X-100, substàncies químiques habituals en els tampons de lisi cel·lular però que alteren dos assaigs més antics: els mètodes de Bradford i Lowry.

Fórmula per convertir l’absorbància BCA en volum de mostra

Una corba patró de BCA és una recta ajustada que representa l’absorbància en funció de la concentració:

$\text{Absorbància} = \text{Pendent} \times \text{Concentració} + \text{Ordenada a l’origen}$

Per fer el càlcul invers, de l’absorbància mesurada a la concentració de proteïna, cal invertir l’equació:

$\text{Concentració de proteïna (μg/μL)} = \frac{\text{Absorbància} - \text{Ordenada a l’origen}}{\text{Pendent}}$

Un cop coneguda la concentració, el volum de mostra que conté una massa determinada de proteïna és:

$\text{Volum de mostra (μL)} = \frac{\text{Massa de mostra (μg)}}{\text{Concentració de proteïna (μg/μL)}}$

La calculadora ofereix quatre tipus de corba preestablerts, cadascun amb la seva pendent i ordenada a l’origen. L’ordenada a l’origen és 0 en tots els valors preestablerts perquè les lectures es corregeixen respecte del blanc (primer es resta l’absorbància d’un control sense proteïna). La pendent reflecteix quina part del rang d’absorbància de la placa cobreix el rang de treball de cada protocol.

Un protocol més sensible, dissenyat per a mostres diluïdes, produeix més absorbància per microgram de proteïna i, per tant, té una pendent més gran. Els protocols BCA millorat i Micro BCA estan pensats per a mostres massa diluïdes perquè el protocol estàndard les mesuri amb precisió.

Com calcular el volum de mostra a partir de l’absorbància BCA

1. Feu l’assaig BCA i llegiu l’absorbància a 562 nm per a cada mostra.
2. Trieu el tipus de corba que correspon al protocol utilitzat (estàndard, millorat o Micro), o introduïu la pendent i l’ordenada a l’origen obtingudes d’una corba generada aquell dia.
3. Introduïu la lectura d’absorbància i la massa de proteïna objectiu, en micrograms, per a cada mostra.
4. La calculadora converteix l’absorbància en concentració de proteïna i després divideix la massa objectiu per aquesta concentració per obtenir el volum que cal pipetejar.

Exemple: càlcul del volum de mostra a partir de l’absorbància BCA

Un investigador que prepara un western blot necessita 20 μg de proteïna per carril i utilitza la corba BCA estàndard (pendent 1,0, ordenada a l’origen 0).

Mostra A presenta una absorbància de 0,75:

• Concentració de proteïna = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 μg/μL
• Volum de mostra = 20 μg ÷ 0,75 μg/μL = 26,67 μL

Mostra B presenta una absorbància de 1,2:

• Concentració de proteïna = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 μg/μL
• Volum de mostra = 20 μg ÷ 1,2 μg/μL = 16,67 μL

La mostra A és més diluïda i, per tant, cal un volum més gran per assolir el mateix objectiu de 20 μg.

Interpretació dels resultats de la calculadora

La calculadora indica dos valors per a cada mostra: la concentració de proteïna, en μg/μL, i el volum de mostra, en μL. També assenyala els resultats que probablement causaran problemes:

• Una absorbància superior a 3,0 activa un avís, ja que les lectures BCA habituals se situen entre 0 i 2,0.
• Una absorbància inferior a 0,05 (però superior a zero) activa un avís que indica que el resultat pot ser menys precís, perquè un senyal baix és més sensible al soroll de mesura.
• Un volum calculat de 1000 μL o més activa un avís que recomana utilitzar una mostra més concentrada.
• Un volum calculat inferior a 0,5 μL activa un avís que indica que pot ser difícil pipetejar el volum amb precisió.
• Les absorbàncies negatives o les masses de mostra negatives es rebutgen directament.

Usos pràctics al laboratori

La càrrega uniforme de proteïna és una de les causes de fallada més habituals en un western blot: una intensitat desigual de les bandes entre carrils sovint reflecteix una càrrega desigual de proteïna, no diferències reals en l’expressió. Calcular el volum exacte de cada mostra a partir de la seva pròpia lectura d’absorbància manté uniforme la càrrega a tot el gel.

El mateix càlcul s’aplica als assaigs enzimàtics, en què comparar l’activitat entre condicions requereix començar amb la mateixa quantitat total de proteïna, i a la immunoprecipitació, en què una quantitat desigual de proteïna d’entrada (per exemple, 800 μg en un tub i 1200 μg en un altre) dificulta la comparació dels resultats. Durant la purificació de proteïnes, s’utilitza la mateixa fórmula a cada pas per controlar quanta proteïna es conserva en cada fracció.

Comparació amb altres assaigs de proteïnes

Breu història de la quantificació de proteïnes

La mesura inicial de proteïnes es basava en el mètode de Kjeldahl (1883), que mesurava el contingut de nitrogen després de digerir una mostra en àcid. La prova del biuret, desenvolupada a principis dels anys 1900, utilitzava una reacció de color entre els enllaços peptídics i els ions de coure, però no era gaire sensible. Oliver Lowry va combinar la reacció del biuret amb un reactiu addicional el 1951, i va crear el mètode de Lowry, que va dominar la mesura de proteïnes durant dècades malgrat que l’alteraven substàncies químiques habituals del laboratori, com els detergents i l’EDTA. Marion Bradford va introduir un mètode més ràpid basat en la unió d’un colorant el 1976, però també fallava en presència de detergents i variava segons el contingut d’aminoàcids de la proteïna. Paul Smith i els seus col·laboradors de Pierce Chemical Company van publicar el mètode BCA el 1985, que combinava la química del biuret amb la sensibilitat més gran de l’àcid bicinconínic al coure i produïa un assaig que tolera els detergents presents en els lisats cel·lulars habituals.

Exemple de codi

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Preguntes més freqüents

Per a què s’utilitza l’assaig BCA? Mesura la concentració total de proteïna en una solució, sobretot abans de carregar quantitats iguals de proteïna per a un western blot, abans de normalitzar assaigs d’activitat enzimàtica o mentre se’n controla el rendiment durant la purificació de proteïnes.

Quina precisió té l’assaig BCA? En bones condicions, els resultats solen tenir una precisió d’entre 5–10%, sempre que la corba patró tingui almenys cinc o sis punts i la mostra no contingui una concentració elevada d’una substància interferent.

Què interfereix amb els resultats de l’assaig BCA? Els agents reductors, com el DTT i el β-mercaptoetanol, augmenten artificialment l’absorbància perquè redueixen el coure pel seu compte, independentment de la proteïna. Els agents quelants, com l’EDTA, redueixen l’absorbància perquè s’uneixen al coure abans que pugui reaccionar.

Quina diferència hi ha entre els assaigs BCA i Bradford? El Bradford dona un resultat en uns cinc minuts, però els detergents l’alteren i reacciona de manera diferent segons la composició d’aminoàcids de la proteïna. El BCA triga aproximadament 30 minuts, però tolera els detergents i proporciona lectures més uniformes entre proteïnes diferents, cosa que el converteix en una opció millor per als lisats cel·lulars.

Per què el volum de mostra calculat és inusualment gran? Un volum gran significa que la concentració de proteïna mesurada és inferior a l’esperada. Les causes habituals inclouen una lisi cel·lular incompleta, una mostra massa diluïda o una lectura d’absorbància propera al límit inferior de detecció de l’assaig. Concentrar la mostra amb un filtre centrífug o canviar al protocol BCA millorat o Micro BCA sol resoldre el problema.

Què cal fer si l’absorbància queda fora del rang lineal? Diluïu la mostra i torneu-ne a mesurar l’absorbància. La relació entre absorbància i concentració es desvia per sobre d’aproximadament 2,0, de manera que extrapolar més enllà de la corba patró subestima la concentració real.

Referències

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. «Measurement of protein using bicinchoninic acid.» Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85.
2. Thermo Fisher Scientific. «Pierce BCA Protein Assay Kit», guia de l’usuari (MAN0011430).
3. Bradford MM. «A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein.» Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.