Kalkulátor rozpustnosti proteinů - Bezplatný nástroj pro pH a teplotu

Kalkulátor rozpustnosti bílkovin odhaduje nejvyšší koncentraci bílkoviny, která zůstane rozpuštěná v rozpouštědle při daném pH, teplotě a iontové síle. Převádí základní chemii na jediné číslo v miligramech bílkoviny na mililitr rozpouštědla.

Rozpustnost bílkovin je důležitá v biochemii, při formulaci léčiv a v potravinářství. Bílkovina, která nezůstane rozpuštěná, vytváří agregáty nebo sraženiny, což může znehodnotit experiment nebo znemožnit injekční podání léčiva.

Jak vypočítat rozpustnost bílkovin

Rozpustnost závisí na pěti věcech: izoelektrickém bodu bílkoviny (pH, při kterém je její výsledný náboj nulový), teplotě tání (teplotě, při které se začíná rozvíjet), dielektrické konstantě rozpouštědla (míře toho, jak dobře odděluje nabité částice), pH roztoku a iontové síle (míře množství rozpuštěné soli).

Kalkulátor vychází ze známé rozpustnosti každé bílkoviny ve vodě za referenčních podmínek: 25 °C, pH 7,0 a iontové síly 0,15 M (přibližně odpovídající koncentraci soli v krvi). Tuto referenční hodnotu pak násobí čtyřmi poměry, po jednom pro každou změněnou podmínku.

Vzorec pro rozpustnost bílkovin

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ je známá rozpustnost bílkoviny ve vodě za referenčních podmínek, v mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, kde $pI$ je izoelektrický bod bílkoviny. Rozpustnost je nejnižší v izoelektrickém bodě a s odchylováním pH od této hodnoty roste; během několika jednotek pH se ustálí.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, kde $I$ je iontová síla v molech na litr. Při nízké koncentraci soli tento člen rozpustnost mírně zvyšuje („nasolování“). Při vysoké koncentraci soli ji snižuje („vysolování“).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, kde $T_m$ je teplota tání bílkoviny ve °C. Rozpustnost s teplotou mírně roste, poté prudce klesá, jakmile se teplota přiblíží k $T_m$ a bílkovina se začne rozvíjet.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, kde $\varepsilon$ je dielektrická konstanta rozpouštědla. Voda má dielektrickou konstantu 78,4, takže tento člen se ve vodě rovná 1. Rozpouštědla, která oddělují náboje méně účinně než voda, například ethanol, rozpustnost snižují.

Referenční hodnoty používané kalkulátorem

Kategorie rozpustnosti

Příklad: albumin ve fosfátovém pufru

Určete rozpustnost albuminu ve fosfátovém pufru při 25 °C, pH 7,4 a iontové síle 0,15 M.

Referenční hodnoty albuminu jsou $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml a $T_m = 63°C$. Fosfátový pufr má dielektrickou konstantu 76,0.

1. Člen pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Poměr: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Iontový člen: iontová síla (0,15 M) se rovná referenční hodnotě, takže poměr je 1.
3. Teplotní člen: teplota (25 °C) se rovná referenční hodnotě, takže poměr je 1.
4. Člen rozpouštědla: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/ml}$

Kalkulátor uvádí 492,12 mg/ml, což spadá do kategorie „velmi rozpustná“.

Příklad: lysozym v glycerolu při nízké teplotě

Určete rozpustnost lysozymu v glycerolovém roztoku při 4 °C, pH 5,0 a iontové síle 0,1 M. Jde o podmínky podobné skladování enzymu v chladu.

Referenční hodnoty lysozymu jsou $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/ml a $T_m = 72°C$. Glycerol má dielektrickou konstantu 42,5.

1. Člen pH: změna z pH 7,0 na pH 5,0 (obě hodnoty jsou výrazně nižší než pI 11,35) mění člen pH jen mírně. Poměr: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Iontový člen: snížení iontové síly z 0,15 M na 0,1 M mírně zvyšuje rozpustnost vlivem efektu zasolování. Poměr: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Teplotní člen: ochlazení z 25 °C na 4 °C, tedy výrazně pod bodem tání, tento člen snižuje. Poměr: 0,8106.
4. Člen rozpouštědla: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/ml}$

Kalkulátor uvádí 35,88 mg/ml, což spadá do kategorie „rozpustná“. Výsledek snižuje oproti referenční hodnotě nízká dielektrická konstanta glycerolu, nikoli nízká teplota.

Jak používat kalkulátor rozpustnosti bílkovin

1. Vyberte bílkovinu ze seznamu: albumin, inzulin, lysozym, hemoglobin, myoglobin, kolagen, kasein nebo fibrinogen.
2. Vyberte rozpouštědlo: vodu, fosfátový pufr, Tris pufr, glycerol, DMSO, methanol, ethanol nebo aceton.
3. Zadejte teplotu ve °C (0 až 100), pH (0 až 14) a iontovou sílu v mol/l (0 až 2).
4. Odečtěte vypočtenou rozpustnost v mg/ml a její kategorii. Lišta pod výsledkem zobrazuje hodnotu na stupnici od 0 do 100 mg/ml a při hodnotě 100 mg/ml nebo vyšší se zcela vyplní.

Co ovlivňuje rozpustnost bílkovin

pH a izoelektrický bod. Každá bílkovina má izoelektrický bod, tedy pH, při kterém její povrch nenese výsledný elektrický náboj. Při tomto pH se molekuly bílkovin navzájem neodpuzují, takže se snadněji shlukují a vypadávají z roztoku. Odchýlení pH od izoelektrického bodu kterýmkoli směrem dodá bílkovině výsledný náboj. Nabité molekuly se navzájem odpuzují, což je udržuje oddělené a rozpuštěné.

Iontová síla. Rozpuštěné ionty soli obklopují nabité povrchové skupiny bílkoviny. Při nízkých až středních koncentracích tyto ionty stíní náboje, které by jinak přitahovaly dvě molekuly bílkoviny k sobě, a tím zvyšují rozpustnost. Tento jev se nazývá solubilizace působením soli. Při vysokých koncentracích soli ionty soutěží s bílkovinou o molekuly vody a odstraňují vrstvu vody, která udržuje bílkovinu rozpuštěnou. Tento jev se nazývá vysolování a tvoří základ běžné metody čištění, při níž se k vysrážení bílkovin ze směsi používá síran amonný.

Teplota. Zahřívání roztoku obecně rozpustnost až do určitého bodu zvyšuje. Jakmile se teplota přiblíží k teplotě denaturace bílkoviny, bílkovina se začne rozvíjet. Rozvinutí odhalí hydrofobní (vodu odpuzující) části bílkoviny, které jsou obvykle skryté uvnitř její sbalené struktury. Tyto odhalené části se navzájem spojují, což způsobuje agregaci, takže rozpustnost v blízkosti teploty denaturace a při teplotách nad ní prudce klesá.

Rozpouštědlo. Dielektrická konstanta rozpouštědla vyjadřuje, jak účinně oslabuje elektrickou přitažlivost mezi nabitými částicemi. Voda má vysokou dielektrickou konstantu a dobře odděluje náboje, což je důvod, proč se většina bílkovin rozpouští ve vodě lépe než v organických rozpouštědlech, jako je ethanol nebo aceton. Rozpouštědla s nízkou dielektrickou konstantou umožňují, aby se opačné náboje na různých molekulách bílkovin navzájem silněji přitahovaly, a podporují tak agregaci.

Omezení

Kalkulátor používá zjednodušený model založený na malé sadě referenčních bílkovin a standardních rozpouštědel. Nezohledňuje čistotu bílkoviny, přísady, jako jsou detergenty nebo stabilizátory, ani neobvyklé složky pufru. Výsledky jsou odhady pro plánování experimentů, nikoli náhrada za přímé měření rozpustnosti v laboratoři.

Často kladené otázky

Co je rozpustnost bílkovin? Rozpustnost bílkovin je maximální koncentrace bílkoviny, která zůstává v rozpouštědle zcela rozpuštěná, aniž by vytvářela viditelné agregáty nebo sraženinu.

Proč je bílkovina nejméně rozpustná v izoelektrickém bodě? V izoelektrickém bodě bílkovina nenese výsledný elektrický náboj, takže se molekuly bílkovin již elektricky neodpuzují. Bez tohoto odpuzování se pravděpodobněji spojí a vypadnou z roztoku.

Jaký je rozdíl mezi zasolováním a vysolováním? Zasolování nastává při nízkých koncentracích soli, kdy rozpuštěné ionty stíní nabité skupiny bílkoviny navzájem a zvyšují rozpustnost. Vysolování nastává při vysokých koncentracích soli, kdy ionty odnímají vodu z povrchu bílkoviny a rozpustnost snižují.

Zvyšuje vyšší teplota vždy rozpustnost? Ne. Rozpustnost má tendenci s teplotou růst jen do určitého bodu. Jakmile se teplota přiblíží teplotě tání bílkoviny, bílkovina se začne rozvíjet, což obvykle způsobí agregaci a prudký pokles rozpustnosti.

Proč se bílkoviny rozpouštějí v ethanolu nebo acetonu méně než ve vodě? Voda má vysokou dielektrickou konstantu, což znamená, že velmi účinně oslabuje elektrickou přitažlivost mezi nabitými částmi molekul bílkovin. Ethanol a aceton mají dielektrické konstanty nižší, takže se nabité skupiny na různých molekulách bílkovin v těchto rozpouštědlech přitahují silněji a agregace je pravděpodobnější.

Jak přesný je tento kalkulátor? Poskytuje odhad založený na fyzikálním modelu a malé sadě referenčních bílkovin a rozpouštědel. Je užitečný pro zúžení podmínek, které je třeba otestovat, ale rozpustnost konkrétního vzorku bílkoviny lze potvrdit pouze experimentálním měřením.

Další četba

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanismus vysolování bílkovin dovnitř a vysolování solemi dvojmocných kationtů. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Měření a zvyšování rozpustnosti bílkovin. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteiny, aminokyseliny a peptidy jako ionty a dipolární ionty. Reinhold Publishing.