Vypočítejte přesné objemy vzorků na základě měření absorbance BCA testu a požadované hmotnosti proteinu. Nezbytné pro konzistentní zatížení proteinů v western blotech a dalších laboratorních aplikacích.
Tento nástroj vypočítá požadovaný objem vzorku na základě výsledků absorbance BCA a hmotnosti vzorku. Zadejte hodnotu absorbance a hmotnost vzorku pro každý vzorek, abyste vypočítali odpovídající objem vzorku.
Objem vzorku se vypočítá pomocí následujícího vzorce:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Kalkulátor objemu vzorku BCA absorbance je specializovaný nástroj navržený pro pomoc výzkumníkům a laborantům přesně určit vhodný objem vzorku pro experimenty na základě výsledků BCA (bicinchoninské kyseliny) assay. Tento kalkulátor bere absorbance naměřené ve vaší BCA assay a požadovanou hmotnost vzorku, aby vypočítal přesný objem potřebný pro konzistentní zatížení proteinu v aplikacích, jako je western blotting, enzymatické assay a další techniky analýzy proteinů.
BCA assay je jednou z nejpoužívanějších metod pro kvantifikaci proteinů v biochemických a molekulárně biologických laboratořích. Měření absorbance vašich proteinových vzorků a jejich porovnání se standardní křivkou vám umožňuje určit koncentraci proteinu s vysokou přesností. Náš kalkulátor tento proces zjednodušuje tím, že automaticky převádí absorbance na přesné objemy vzorků potřebné pro vaše experimenty.
Bicinchoninská kyselina (BCA) assay je biochemická metoda pro určení celkové koncentrace proteinu v roztoku. Princip této assay spočívá ve vytváření komplexu Cu²⁺-protein za alkalických podmínek, následovaném redukcí Cu²⁺ na Cu¹⁺. Množství redukce je úměrné přítomnému proteinu. BCA vytváří purpurový komplex s Cu¹⁺ v alkalických prostředích, což poskytuje základ pro sledování redukce mědi proteiny.
Intenzita purpurové barvy se zvyšuje úměrně s koncentrací proteinu, což lze měřit pomocí spektrofotometru při přibližně 562 nm. Naměřené absorbance se poté porovnávají se standardní křivkou pro určení koncentrace proteinu v neznámých vzorcích.
Základní vzorec pro výpočet objemu vzorku z výsledků BCA absorbance je:
Kde:
Koncentrace proteinu se vypočítá z naměřené absorbance pomocí rovnice standardní křivky:
Pro standardní BCA assay je typický sklon přibližně 2.0 a průsečík je často blízko nuly, ačkoliv tyto hodnoty se mohou lišit v závislosti na vašich konkrétních podmínkách assay a standardní křivce.
Náš kalkulátor zjednodušuje proces určování objemů vzorků z výsledků BCA assay. Postupujte podle těchto kroků pro přesné výpočty:
Zadejte informace o vzorku:
Vyberte typ standardní křivky:
Zobrazit výsledky:
Kopírovat nebo exportovat výsledky:
Pojďme projít praktickým příkladem:
To znamená, že byste měli naložit 13.33 μL vašeho vzorku, abyste získali 20 μg proteinu.
Kalkulátor poskytuje několik důležitých informací:
Koncentrace proteinu: Tato hodnota se vypočítá z vaší naměřené absorbance pomocí vybrané standardní křivky. Představuje množství proteinu na jednotkový objem ve vašem vzorku (μg/μL).
Objem vzorku: Toto je objem vašeho vzorku, který obsahuje požadované množství proteinu. Tato hodnota je to, co použijete při přípravě vašich experimentů.
Varování a doporučení: Kalkulátor může poskytnout varování pro:
Jednou z nejběžnějších aplikací tohoto kalkulátoru je příprava vzorků pro western blotting. Konzistentní zatížení proteinu je klíčové pro spolehlivé výsledky western blotu, a tento kalkulátor zajišťuje, že naložíte stejné množství proteinu pro každý vzorek, i když se jejich koncentrace liší.
Příklad pracovního postupu:
Pro enzymatické assay je často nutné použít specifické množství proteinu k standardizaci podmínek reakce napříč různými vzorky nebo experimenty.
Příklad pracovního postupu:
V experimentech s imunoprecipitací je důležité začít s konzistentním množstvím proteinu pro porovnání výsledků napříč různými podmínkami.
Příklad pracovního postupu:
Během purifikace proteinů je často nutné sledovat koncentraci proteinu a vypočítat výtěžky v různých krocích.
Příklad pracovního postupu:
Zatímco kalkulátor poskytuje výchozí parametry pro standardní BCA assay, můžete také zadat vlastní hodnoty, pokud jste vytvořili svou vlastní standardní křivku. To je obzvlášť užitečné, když:
Chcete-li použít vlastní standardní křivku:
Kalkulátor vám umožňuje přidat více vzorků a vypočítat jejich objemy současně. To je obzvlášť užitečné při přípravě vzorků pro experimenty, které vyžadují konzistentní zatížení proteinu napříč různými podmínkami.
Výhody hromadného zpracování:
Pokud je vaše naměřená absorbance nad 2.0, může být mimo lineární rozsah BCA assay. V takových případech:
Pro naměřené absorbance pod 0.1 můžete být blízko limita detekce assay, což může ovlivnit přesnost. Zvažte:
Pokud kalkulátor navrhuje objem, který je příliš velký pro vaši aplikaci:
Přesná kvantifikace proteinů byla základním požadavkem v biochemii a molekulární biologii od vzniku těchto oborů. Rané metody se spoléhaly na určení obsahu dusíku, což bylo časově náročné a vyžadovalo specializované vybavení.
Kjeldahlova metoda (1883): Jedna z nejranějších metod pro kvantifikaci proteinů, založená na měření obsahu dusíku.
Biuretův test (začátek 1900): Tato metoda se spoléhá na reakci mezi peptidovými vazbami a ionty mědi v alkalickém roztoku, což produkuje fialovou barvu.
Lowryho assay (1951): Vyvinuta Oliverem Lowrym, tato metoda kombinovala biuretovu reakci s Folin-Ciocalteuovým činidlem, což zvyšuje citlivost.
Bradfordova assay (1976): Marion Bradford vyvinula tuto metodu pomocí barviva Coomassie Brilliant Blue G-250, které se váže na proteiny a posouvá maximální absorpci.
BCA assay (1985): Vyvinuta Paulem Smithem a kolegy z Pierce Chemical Company, tato metoda kombinovala biuretovu reakci s detekcí BCA, nabízející zvýšenou citlivost a kompatibilitu s detergenty.
BCA assay byla poprvé popsána v roce 1985 v článku Smitha a kol. s názvem "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Byla vyvinuta, aby překonala omezení stávajících metod, zejména interferenci s různými chemikáliemi běžně používanými při extrakci a purifikaci proteinů.
Klíčovou inovací bylo použití bicinchoninské kyseliny k detekci iontů Cu¹⁺ produkovaných redukcí Cu²⁺ proteiny, což vytváří purpurový komplex, který lze měřit spektrofotometricky. To poskytlo několik výhod:
Od svého zavedení se BCA assay stala jednou z nejpoužívanějších metod kvantifikace proteinů v biochemických a molekulárně biologických laboratořích po celém světě.
1=IF(B2<=0,"Chyba: Neplatná absorbance",IF(C2<=0,"Chyba: Neplatná hmotnost vzorku",C2/(2*B2)))
2
3' Kde:
4' B2 obsahuje naměřenou absorbanci
5' C2 obsahuje požadovanou hmotnost vzorku v μg
6' Vzorec vrací požadovaný objem vzorku v μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Vypočítá koncentraci proteinu z absorbance pomocí standardní křivky."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbance nemůže být záporná")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Vypočítá požadovaný objem vzorku na základě absorbance a požadované hmotnosti."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Hmotnost vzorku musí být kladná")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Vypočítaná koncentrace proteinu musí být kladná")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Příklad použití
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Pro absorbanci {absorbance} a požadovanou hmotnost proteinu {sample_mass} μg:")
31 print(f"Koncentrace proteinu: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Požadovaný objem vzorku: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Chyba: {e}")
351# Funkce pro výpočet koncentrace proteinu z absorbance
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbance nemůže být záporná")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkce pro výpočet objemu vzorku
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Hmotnost vzorku musí být kladná")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Vypočítaná koncentrace proteinu musí být kladná")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Příklad použití
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Pro absorbanci %.2f a požadovanou hmotnost proteinu %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Koncentrace proteinu: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Požadovaný objem vzorku: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Chyba: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbance nemůže být záporná");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Hmotnost vzorku musí být kladná");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Vypočítaná koncentrace proteinu musí být kladná");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Příklad použití
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Pro absorbanci ${absorbance} a požadovanou hmotnost ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Koncentrace proteinu: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Požadovaný objem vzorku: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Chyba: ${error.message}`);
37}
38Vztah mezi absorbancí a koncentrací proteinu je obvykle lineární v určitém rozsahu. Níže je vizualizace standardní křivky BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Různé metody kvantifikace proteinů mají různé výhody a omezení. Zde je, jak se BCA assay srovnává s jinými běžnými metodami:
| Metoda | Rozsah citlivosti | Výhody | Omezení | Nejlepší pro |
|---|---|---|---|---|
| BCA Assay | 5-2000 μg/mL | • Kompatibilní s detergenty • Menší variabilita mezi proteiny • Stabilní vývoj barvy | • Rušeny redukčními činidly • Ovlivněny některými chelatačními činidly | • Obecná kvantifikace proteinů • Vzorky obsahující detergenty |
| Bradford Assay | 1-1500 μg/mL | • Rychlá (2-5 min) • Málo rušivých látek | • Vysoká variabilita mezi proteiny • Ne kompatibilní s detergenty | • Rychlé měření • Vzorky bez detergentů |
| Lowryho metoda | 1-1500 μg/mL | • Dobře zavedená • Dobrá citlivost | • Mnoho rušivých látek • Více kroků | • Historická konzistence • Čisté proteinové vzorky |
| UV absorbance (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Neničící • Velmi rychlé • Žádné činidla potřebná | • Ovlivněny nukleovými kyselinami • Vyžaduje čisté vzorky | • Čisté proteinové roztoky • Rychlé kontroly během purifikace |
| Fluorometrické | 0.1-500 μg/mL | • Nejvyšší citlivost • Široký dynamický rozsah | • Drahá činidla • Vyžaduje fluorometr | • Velmi zředěné vzorky • Omezený objem vzorku |
BCA (bicinchoninská kyselina) assay se primárně používá pro kvantifikaci celkové koncentrace proteinu ve vzorku. Je široce používána v biochemii, buněčné biologii a molekulární biologii pro aplikace, jako je western blotting, enzymatické assay, imunoprecipitace a purifikace proteinů.
BCA assay je obecně přesná v rozmezí 5-10%, pokud je provedena správně. Její přesnost závisí na několika faktorech, včetně kvality standardní křivky, absence rušivých látek a zda je složení neznámého proteinu podobné standardnímu proteinu použitému.
S několika látkami může interferovat s výsledky BCA assay, včetně:
Hlavní rozdíly jsou:
Pokud váš kalkulátor ukazuje velmi velký objem vzorku, obvykle to naznačuje nízkou koncentraci proteinu ve vašem vzorku. To může být způsobeno:
Zvažte koncentraci vašeho vzorku nebo úpravu vašeho experimentálního designu, aby vyhovoval nižším koncentracím proteinu.
Tento kalkulátor je speciálně navržen pro výsledky BCA assay. Ačkoliv základní princip (převod koncentrace na objem) platí i pro jiné metody, vztah mezi absorbancí a koncentrací proteinu se liší mezi různými assay. Pro jiné metody, jako je Bradford nebo Lowry, byste museli použít různé parametry standardní křivky.
Pro naměřené absorbance mimo lineární rozsah (typicky >2.0):
Bovinný sérový albumin (BSA) je nejčastěji používaný standard pro BCA assay, protože je:
Pokud však vaše vzorky obsahují převládající protein, který se výrazně liší od BSA, zvažte použití tohoto proteinu jako vašeho standardu pro přesnější výsledky.
Purpurová barva vyvinutá v reakci BCA je stabilní několik hodin při pokojové teplotě a může být měřena kdykoliv v tomto období. Pro nejlepší výsledky se však doporučuje měřit všechny standardy a vzorky přibližně ve stejnou dobu po vývoji barvy.
Ačkoliv je technicky možné znovu použít standardní křivku, pro přesnou kvantifikaci to není doporučeno. Variace v činidlech, podmínkách inkubace a kalibraci přístroje mohou ovlivnit vztah mezi absorbancí a koncentrací proteinu. Pro spolehlivé výsledky generujte čerstvou standardní křivku pokaždé, když provedete assay.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Pokyny. Dostupné na: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Nyní, když rozumíte principům kvantifikace proteinu BCA a výpočtu objemu vzorku, vyzkoušejte náš kalkulátor, abyste zjednodušili svůj laboratorní pracovní postup. Jednoduše zadejte své naměřené absorbance a požadovanou hmotnost vzorku a získejte okamžité, přesné výpočty objemu vzorku.
Ať už připravujete vzorky pro western blotting, enzymatické assay nebo jakýkoli jiný experiment založený na proteinech, náš kalkulátor pomůže zajistit konzistentní a spolehlivé výsledky. Ušetřete čas, snižte chyby a zlepšete reprodukovatelnost svých experimentů s kalkulátorem objemu vzorku BCA absorbance.
Objevte další nástroje, které by mohly být užitečné pro vaši pracovní postup.