Beregn præcise prøvevolumener baseret på BCA-assayets absorbansmålinger og ønsket proteinmasse. Uundgåelig for ensartet proteinbelastning i western blots og andre laboratorieapplikationer.
Dette værktøj beregner den nødvendige prøvevolumen baseret på BCA absorbansresultater og prøvevægt. Indtast absorbansværdien og prøvevægten for hver prøve for at beregne den tilsvarende prøvevolumen.
Prøvevolumen beregnes ved hjælp af følgende formel:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbans Prøvevolumen Beregneren er et specialiseret værktøj designet til at hjælpe forskere og laboratorieteknikere med nøjagtigt at bestemme det passende prøvevolumen til eksperimenter baseret på BCA (bicinchoninsyre) assays. Denne beregner tager absorbansmålingerne fra dit BCA assay og din ønskede prøvevægt for at beregne det præcise volumen, der er nødvendigt for ensartet proteinbelastning i applikationer såsom western blotting, enzymatiske assays og andre proteinanalyseteknikker.
BCA assayet er en af de mest anvendte metoder til proteinkvantificering i biokemi og molekylærbiologi laboratorier. Ved at måle absorbansen af dine proteinprøver og sammenligne dem med en standardkurve kan du bestemme protein koncentrationen med høj nøjagtighed. Vores beregner strømline denne proces ved automatisk at konvertere absorbansmålinger til de nøjagtige prøvevolumener, der kræves til dine eksperimenter.
Bicinchoninsyre (BCA) assayet er en biokemisk assay til bestemmelse af den samlede koncentration af protein i en opløsning. Princippet for denne assay er baseret på dannelsen af et Cu²⁺-protein kompleks under alkaliske forhold, efterfulgt af reduktion af Cu²⁺ til Cu¹⁺. Mængden af reduktion er proportional med det tilstedeværende protein. BCA danner et lilla farvet kompleks med Cu¹⁺ i alkaliske miljøer, hvilket giver en basis for at overvåge reduktionen af kobber af proteiner.
Intensiteten af den lilla farve stiger proportionalt med protein koncentrationen, som kan måles ved hjælp af en spektrofotometer ved cirka 562 nm. Absorbansmålingerne sammenlignes derefter med en standardkurve for at bestemme protein koncentrationen i ukendte prøver.
Den grundlæggende formel til beregning af prøvevolumen fra BCA absorbansresultater er:
Hvor:
Protein koncentrationen beregnes fra absorbansmålingen ved hjælp af en standardkurve ligning:
For et standard BCA assay er den typiske hældning cirka 2.0, og interceptet er ofte tæt på nul, selvom disse værdier kan variere baseret på dine specifikke assaybetingelser og standardkurve.
Vores beregner forenkler processen med at bestemme prøvevolumener fra BCA assayresultater. Følg disse trin for at få nøjagtige beregninger:
Indtast Prøveinformation:
Vælg Standardkurvetype:
Se Resultater:
Kopier eller Eksporter Resultater:
Lad os gå igennem et praktisk eksempel:
Det betyder, at du skal indlæse 13.33 μL af din prøve for at få 20 μg protein.
Beregneren giver flere vigtige oplysninger:
Protein koncentration: Dette beregnes fra din absorbansmåling ved hjælp af den valgte standardkurve. Det repræsenterer mængden af protein pr. enhedsvolumen i din prøve (μg/μL).
Prøvevolumen: Dette er volumen af din prøve, der indeholder den ønskede mængde protein. Denne værdi er, hvad du vil bruge, når du forbereder dine eksperimenter.
Advarsler og Anbefalinger: Beregneren kan give advarsler for:
En af de mest almindelige anvendelser for denne beregner er at forberede prøver til western blotting. Ensartet proteinbelastning er afgørende for pålidelige western blot resultater, og denne beregner sikrer, at du indlæser den samme mængde protein for hver prøve, selv når deres koncentrationer varierer.
Eksempel arbejdsforløb:
Til enzymatiske assays er det ofte nødvendigt at bruge en specifik mængde protein for at standardisere reaktionsbetingelserne på tværs af forskellige prøver eller eksperimenter.
Eksempel arbejdsforløb:
I immunpræcipitation (IP) eksperimenter er det vigtigt at starte med en ensartet mængde protein for at sammenligne resultater på tværs af forskellige betingelser.
Eksempel arbejdsforløb:
Under proteinrensning er det ofte nødvendigt at spore protein koncentration og beregne udbytter på forskellige trin.
Eksempel arbejdsforløb:
Selvom beregneren giver standardparametre for standard BCA assays, kan du også indtaste tilpassede værdier, hvis du har genereret din egen standardkurve. Dette er især nyttigt, når:
For at bruge en tilpasset standardkurve:
Beregneren giver dig mulighed for at tilføje flere prøver og beregne deres volumener samtidig. Dette er især nyttigt, når du forbereder prøver til eksperimenter, der kræver ensartet proteinbelastning på tværs af flere betingelser.
Fordele ved batchbehandling:
Hvis din absorbansmåling er over 2.0, kan det være uden for det lineære område af BCA assayet. I sådanne tilfælde:
For absorbansmålinger under 0.1 kan du være tæt på detektionsgrænsen for assayet, hvilket kan påvirke nøjagtigheden. Overvej:
Hvis beregneren foreslår et volumen, der er for stort til din applikation:
Den nøjagtige kvantificering af proteiner har været et grundlæggende krav inden for biokemi og molekylærbiologi, siden disse felter opstod. Tidlige metoder var baseret på bestemmelse af nitrogenindhold, hvilket var tidskrævende og krævede specialiseret udstyr.
Kjeldahl Metode (1883): En af de tidligste metoder til protein kvantificering, baseret på måling af nitrogenindhold.
Biuret Test (Tidligt 1900-tallet): Denne metode er baseret på reaktionen mellem peptidbindinger og kobberioner i en alkalisk opløsning, hvilket producerer en violet farve.
Lowry Assay (1951): Udviklet af Oliver Lowry, kombinerede denne metode Biuret reaktionen med Folin-Ciocalteu reagenset, hvilket øgede følsomheden.
Bradford Assay (1976): Marion Bradford udviklede denne metode ved hjælp af Coomassie Brilliant Blue G-250 farvestof, som binder til proteiner og skifter absorptionsmaksimum.
BCA Assay (1985): Udviklet af Paul Smith og kolleger ved Pierce Chemical Company, kombinerede denne metode Biuret reaktionen med BCA detektion, hvilket tilbød forbedret følsomhed og kompatibilitet med sæbe.
BCA assayet blev først beskrevet i en artikel fra 1985 af Smith et al. med titlen "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Det blev udviklet for at imødekomme begrænsningerne ved eksisterende metoder, især forstyrrelser fra forskellige kemikalier, der ofte anvendes i proteinudvinding og -rensning.
Den nøgleinnovation var brugen af bicinchoninsyre til at detektere Cu¹⁺ ioner produceret ved proteinmedieret reduktion af Cu²⁺, hvilket danner et lilla farvet kompleks, der kunne måles spektrofotometrisk. Dette gav flere fordele:
Siden sin introduktion er BCA assayet blevet en af de mest anvendte metoder til protein kvantificering i biokemi og molekylærbiologi laboratorier verden over.
1=IF(B2<=0,"Fejl: Ugyldig absorbans",IF(C2<=0,"Fejl: Ugyldig prøvevægt",C2/(2*B2)))
2
3' Hvor:
4' B2 indeholder absorbansmålingen
5' C2 indeholder den ønskede prøvevægt i μg
6' Formlen returnerer det krævede prøvevolumen i μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Beregner protein koncentration fra absorbans ved hjælp af standardkurve."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbans kan ikke være negativ")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Beregner nødvendigt prøvevolumen baseret på absorbans og ønsket masse."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Prøvevægt skal være positiv")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Beregnet protein koncentration skal være positiv")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Eksempel brug
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"For absorbans {absorbance} og ønsket proteinmasse {sample_mass} μg:")
31 print(f"Protein koncentration: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Nødvendigt prøvevolumen: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Fejl: {e}")
351# Funktion til at beregne protein koncentration fra absorbans
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbans kan ikke være negativ")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funktion til at beregne prøvevolumen
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Prøvevægt skal være positiv")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Beregnet protein koncentration skal være positiv")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Eksempel brug
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("For absorbans %.2f og ønsket proteinmasse %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Protein koncentration: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Nødvendigt prøvevolumen: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Fejl: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbans kan ikke være negativ");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Prøvevægt skal være positiv");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Beregnet protein koncentration skal være positiv");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Eksempel brug
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`For absorbans ${absorbance} og ønsket proteinmasse ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Protein koncentration: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Nødvendigt prøvevolumen: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Fejl: ${error.message}`);
37}
38Forholdet mellem absorbans og protein koncentration er typisk lineært inden for et bestemt område. Nedenfor er en visualisering af en standard BCA kurve:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Forskellige protein kvantificeringsmetoder har forskellige fordele og begrænsninger. Her er hvordan BCA assayet sammenlignes med andre almindelige metoder:
| Metode | Følsomhedsområde | Fordele | Begrænsninger | Bedst til |
|---|---|---|---|---|
| BCA Assay | 5-2000 μg/mL | • Kompatibel med sæber • Mindre protein-til-protein variation • Stabil farveudvikling | • Forstyrret af reducerende midler • Påvirket af nogle chelaterende midler | • Generel protein kvantificering • Prøver der indeholder sæber |
| Bradford Assay | 1-1500 μg/mL | • Hurtig (2-5 min) • Få forstyrrende stoffer | • Høj protein-til-protein variation • Inkompatibel med sæber | • Hurtige målinger • Sæbefri prøver |
| Lowry Metode | 1-1500 μg/mL | • Velkendt • God følsomhed | • Mange forstyrrende stoffer • Flere trin | • Historisk konsistens • Rene protein prøver |
| UV Absorbans (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Ikke-destruktiv • Meget hurtig • Ingen reagenser nødvendige | • Påvirket af nukleinsyrer • Kræver rene prøver | • Rene protein opløsninger • Hurtige tjek under rensning |
| Fluorometrisk | 0.1-500 μg/mL | • Højeste følsomhed • Bred dynamisk rækkevidde | • Dyre reagenser • Kræver fluorometer | • Meget fortyndede prøver • Begrænset prøvevolumen |
BCA (bicinchoninsyre) assayet bruges primært til at kvantificere den samlede protein koncentration i en prøve. Det er meget anvendt inden for biokemi, cellebiologi og molekylærbiologi til applikationer såsom western blotting, enzymatiske assays, immunpræcipitation og proteinrensning.
BCA assayet er generelt nøjagtigt inden for 5-10%, når det udføres korrekt. Dets nøjagtighed afhænger af flere faktorer, herunder kvaliteten af standardkurven, fraværet af forstyrrende stoffer, og om den ukendte proteins sammensætning ligner den standardprotein, der anvendes.
Flere stoffer kan forstyrre BCA assay resultaterne, herunder:
De vigtigste forskelle er:
Hvis din beregner viser et meget stort prøvevolumen, indikerer det normalt en lav protein koncentration i din prøve. Dette kan skyldes:
Overvej at koncentrere din prøve eller justere dit eksperimentelle design for at imødekomme den lavere protein koncentration.
Denne beregner er specifikt designet til BCA assay resultater. Selvom det grundlæggende princip (at konvertere koncentration til volumen) gælder for andre metoder, varierer forholdet mellem absorbans og protein koncentration mellem forskellige assays. For andre metoder som Bradford eller Lowry skal du bruge forskellige standardkurveparametre.
For absorbansmålinger uden for det lineære område (typisk >2.0):
Bovin serum albumin (BSA) er den mest almindeligt anvendte standard for BCA assays, fordi det er:
Men hvis dine prøver indeholder et dominerende protein, der adskiller sig betydeligt fra BSA, kan du overveje at bruge det protein som din standard for mere nøjagtige resultater.
Den lilla farve, der udvikles i BCA reaktionen, er stabil i flere timer ved stuetemperatur og kan måles når som helst inden for den periode. For bedste resultater anbefales det dog at måle alle standarder og prøver på omtrent samme tid efter farveudviklingen.
Selvom det teknisk set er muligt at genbruge en standardkurve, anbefales det ikke for nøjagtig kvantificering. Variationer i reagenser, inkubationsbetingelser og instrumentkalibrering kan påvirke forholdet mellem absorbans og protein koncentration. For pålidelige resultater, generer en frisk standardkurve hver gang du udfører assayet.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instruktioner. Tilgængelig på: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Nu hvor du forstår principperne bag BCA protein kvantificering og prøvevolumen beregning, prøv vores beregner for at strømline dit laboratoriearbejde. Indtast blot dine absorbansmålinger og ønskede prøvevægt for at få øjeblikkelige, nøjagtige prøvevolumen beregninger.
Uanset om du forbereder prøver til western blotting, enzymatiske assays eller enhver anden proteinbaseret eksperiment, vil vores beregner hjælpe med at sikre konsistente og pålidelige resultater. Spar tid, reducer fejl og forbedr reproducerbarheden af dine eksperimenter med BCA Absorbans Prøvevolumen Beregneren.
Opdag flere værktøjer, der måske kan være nyttige for din arbejdsgang.