Υπολογιστής Σύνδεσης DNA - Υπολογισμός Αναλογιών Ένθεσης:Φορέα για Μοριακή Κλωνοποίηση

Η σύνδεση DNA είναι το στάδιο της μοριακής κλωνοποίησης κατά το οποίο ένα ένθετο τμήμα συνδέεται με έναν πλασμιδιακό φορέα μέσω του ενζύμου T4 DNA λιγάση. Ένας υπολογιστής σύνδεσης DNA υπολογίζει πόσα μικρολίτρα DNA ενθέματος και DNA φορέα πρέπει να αναμειχθούν, ώστε η αντίδραση να επιτύχει επιλεγμένη μοριακή αναλογία ενθέματος προς φορέα.

Τι κάνει ο υπολογιστής

Ο υπολογιστής δέχεται έξι εισόδους: συγκέντρωση φορέα, μήκος φορέα, συγκέντρωση ενθέματος, μήκος ενθέματος, επιθυμητή μοριακή αναλογία ενθέματος προς φορέα και συνολικό όγκο αντίδρασης. Επιτρέπει επίσης στον χρήστη να ορίσει την ποσότητα DNA φορέα που θα χρησιμοποιηθεί, η οποία από προεπιλογή είναι 50 νανογραμμάρια (ng). Με βάση αυτές τις τιμές υπολογίζει τον όγκο φορέα και τον όγκο ενθέματος που πρέπει να ληφθούν με πιπέτα, καθώς και την ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος ή νερού που πρέπει να προστεθεί για να επιτευχθεί ο συνολικός όγκος της αντίδρασης.

Η συγκέντρωση μετριέται σε νανογραμμάρια ανά μικρολίτρο (ng/μL), συνήθως με όργανο Nanodrop ή Qubit. Το μήκος μετριέται σε ζεύγη βάσεων (bp). Μία κιλοβάση (kb) ισούται με 1000 ζεύγη βάσεων. Η μοριακή αναλογία περιγράφει πόσα μόρια ενθέματος πρέπει να υπάρχουν για κάθε ένα μόριο φορέα. Δεν είναι αναλογία μάζας.

Γιατί χρησιμοποιείται μοριακή αναλογία και όχι μάζα

Ίσες μάζες DNA δεν περιέχουν ίσο αριθμό μορίων. Ένα μικρό ένθετο ζυγίζει λιγότερο από έναν μακρύ φορέα με τον ίδιο αριθμό μορίων. Η ανάμειξη ίσων ποσοτήτων ενός μικρού ενθέματος και ενός μακρού φορέα, σε νανογραμμάρια, θα άφηνε υπερβολικά λίγα μόρια ενθέματος σε σχέση με τα μόρια φορέα. Ο υπολογιστής κλιμακώνει τη μάζα του ενθέματος με βάση την αναλογία των μηκών των τμημάτων, ώστε το τελικό μείγμα να περιέχει τον επιθυμητό αριθμό μορίων ενθέματος ανά μόριο φορέα.

Τύπος για τη σύνδεση DNA

Η απαιτούμενη ποσότητα DNA ενθέματος, σε νανογραμμάρια, είναι:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

όπου $m_i$ είναι η ποσότητα ενθέματος σε νανογραμμάρια, $m_v$ η ποσότητα φορέα σε νανογραμμάρια, $k_i$ το μήκος του ενθέματος σε kilobases, $k_v$ το μήκος του φορέα σε kilobases και R η επιθυμητή μοριακή αναλογία ενθέματος προς φορέα.

Αφού γίνει γνωστή αυτή η ποσότητα, ο υπολογιστής μετατρέπει κάθε ποσότητα σε όγκο που μπορεί να ληφθεί με πιπέτα:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

όπου $V_v$ και $V_i$ είναι οι όγκοι φορέα και ενθέματος σε μικρολίτρα, $c_v$ και $c_i$ είναι οι συγκεντρώσεις φορέα και ενθέματος σε νανογραμμάρια ανά μικρολίτρο, $V_b$ είναι ο όγκος του ρυθμιστικού διαλύματος και $V_t$ ο συνολικός όγκος της αντίδρασης.

Αν οι όγκοι του φορέα και του ενθέματος μαζί είναι μεγαλύτεροι από τον συνολικό όγκο της αντίδρασης, δεν απομένει χώρος για ρυθμιστικό διάλυμα, λιγάση ή νερό. Σε αυτή την περίπτωση ο υπολογιστής αναφέρει ότι ο συνολικός όγκος είναι πολύ μικρός, αντί να εμφανίσει αρνητική ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος.

Λυμένο παράδειγμα

Ένας ερευνητής κλωνοποιεί ένα γονιδιακό τμήμα μήκους 1 kb σε έναν πλασμιδιακό φορέα μήκους 3 kb. Το σχέδιο είναι να χρησιμοποιηθούν 50 ng DNA φορέα, με μοριακή αναλογία ενθέματος:φορέα 3:1, σε αντίδραση όγκου 20 μL.

Είσοδοι:

• Συγκέντρωση φορέα: 50 ng/μL
• Μήκος φορέα: 3000 bp (3 kb)
• Συγκέντρωση ενθέματος: 25 ng/μL
• Μήκος ενθέματος: 1000 bp (1 kb)
• Μοριακή αναλογία: 3
• Συνολικός όγκος: 20 μL
• Ποσότητα φορέα: 50 ng

Βήμα 1: ποσότητα ενθέματος

ng ενθέματος = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Βήμα 2: όγκοι

Όγκος φορέα = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Όγκος ενθέματος = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Όγκος ρυθμιστικού διαλύματος = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Η αντίδραση αποτελείται από 1 μL φορέα, 2 μL ενθέματος και 17 μL ρυθμιστικού διαλύματος ή νερού, όπου προστίθενται επίσης η λιγάση και το ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασής της. Το μείγμα αυτό δίνει τρία μόρια ενθέματος για κάθε μόριο φορέα.

Τυπικές μοριακές αναλογίες για σύνδεση

Οι περισσότερες τυπικές κλωνοποιήσεις με κολλώδη, προεξέχοντα άκρα χρησιμοποιούν αναλογία ενθέματος:φορέα 3:1. Οι συνδέσεις που ενώνουν αμβλέα άκρα είναι λιγότερο αποτελεσματικές, επομένως είναι συνηθισμένη μια υψηλότερη αναλογία, όπως 5:1. Τα πολύ μεγάλα ένθετα μερικές φορές λειτουργούν καλύτερα με χαμηλότερη αναλογία, κοντά στο 1:1, επειδή τα μεγάλα τμήματα περιέχουν ήδη πολλά ζεύγη βάσεων ανά μόριο.

Συχνές ερωτήσεις

Τι είναι η σύνδεση DNA;

Η σύνδεση DNA είναι η ένωση δύο τμημάτων DNA, συνήθως ενός πλασμιδιακού φορέα και ενός ενθέματος, σε ένα ενιαίο συνεχές μόριο. Το ένζυμο T4 DNA λιγάση σφραγίζει τη σύνδεση μεταξύ των άκρων των τμημάτων.

Τι σημαίνει η μοριακή αναλογία ενθέματος:φορέα;

Είναι ο αριθμός μορίων DNA ενθέματος που υπάρχουν για κάθε ένα μόριο φορέα στην αντίδραση. Αναλογία 3:1 σημαίνει τρία μόρια ενθέματος για κάθε μόριο φορέα, ανεξάρτητα από τη σχέση μεταξύ των μαζών τους.

Γιατί να μη χρησιμοποιούνται ίσες ποσότητες φορέα και ενθέματος σε νανογραμμάρια;

Τμήματα DNA διαφορετικού μήκους έχουν διαφορετική μάζα ανά μόριο. Ένα ένθεμα 1 kb ζυγίζει περίπου το ένα τρίτο ενός φορέα 3 kb, μόριο προς μόριο. Ίσες ποσότητες του καθενός σε νανογραμμάρια δεν θα έδιναν ίσο αριθμό μορίων, επομένως ο υπολογιστής προσαρμόζει τη μάζα του ενθέματος ώστε να επιτευχθεί η επιθυμητή μοριακή αναλογία.

Τι σημαίνει αν ο συνολικός όγκος είναι πολύ μικρός;

Σημαίνει ότι οι όγκοι του φορέα και του ενθέματος από μόνοι τους καταλαμβάνουν ήδη ολόκληρο τον όγκο της αντίδρασης, χωρίς να μένει χώρος για ρυθμιστικό διάλυμα ή λιγάση. Η λύση είναι να αυξηθεί ο συνολικός όγκος της αντίδρασης ή να χρησιμοποιηθούν πιο συμπυκνωμένα διαλύματα DNA.

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτός ο υπολογιστής για κλωνοποίηση Gibson Assembly ή Golden Gate;

Όχι. Οι μέθοδοι αυτές χρησιμοποιούν διαφορετική χημεία αντίδρασης και συνήθως στοχεύουν σε ισομοριακές ποσότητες όλων των τμημάτων, αντί για μια σταθερή αναλογία ενθέματος:φορέα. Οι υπολογισμοί όγκου τους διαφέρουν από εκείνους της τυπικής κλωνοποίησης με T4 λιγάση.

Πόσο DNA φορέα χρησιμοποιείται συνήθως;

Τα 50 ng είναι συνηθισμένη αρχική ποσότητα για μια τυπική αντίδραση σύνδεσης. Τα εργαστήρια χρησιμοποιούν επίσης ποσότητες από 25 έως 100 ng, προσαρμοσμένες στη συγκέντρωση του DNA και στην κλίμακα της αντίδρασης.